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Beginnen Sie damit, eine Lösung mit bakteriellen 16S-rRNA-spezifischen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungssonden (FISH) zu einem Objektträger zu geben, der die von Bakterien besiedelten Maus-Darmabschnitte enthält.
Setzen Sie einen Deckdeckel, um die flüssigkeitshaltigen Sonden zu verteilen und Verdunstung zu verhindern.
Inkubieren Sie den Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei erhöhter Temperatur.
Dadurch entfaltet sich die RNA-Sekundärstruktur und ermöglicht so die Hybridisierung der Sonde mit komplementären Sequenzen in bakterieller 16S-rRNA.
Entfernen Sie den Deckdeckel und inkubieren Sie den Schlitten in einem vorgewärmten Waschpuffer, um ungebundene Sonden zu entfernen.
Spülen Sie mit einem Phosphatpuffer, um den physiologischen pH-Wert zu erhalten.
Tragen Sie eine Gegenfarbe auf, die einen schleimspezifischen Farbstoff und einen Kernfarbe enthält, und inkubieren Sie.
Diese Farbstoffe binden selektiv an den Darmschleim sowie an die DNA von Bakterien- und Wirtszellen. Waschen Sie den Schlitten mit einem Puffer und montieren Sie die Deckdecken mit Montagemedium auf den Schlitten.
Beobachten Sie unter einem konfokalen Mikroskop unterschiedliche FISH-markierte Bakterien, Darmzellen und die Schleimschicht innerhalb der Schnitte.
Erzeugen Sie sehr enge Kreise um jeden Gewebeschnitt mit einem Flüssigkeitsblocker oder einem PAP-Stift, um die Fläche zu begrenzen, die von der Hybridisierungslösung bedeckt werden muss, und vermeiden Sie so den Kontakt von Tinte mit dem Schnitt.
Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor und fügen Sie 0,5 Mikrogramm Sonde pro 50 Mikroliter der verwendeten Lösung hinzu. Pipettiere die Lösung auf die Abschnitte auf dem Objektträger. Überdecken Sie den Abschnitt mit flexiblen Kunststoffabdeckungen, damit das verwendete Flüssigkeitsvolumen den gesamten Abschnitt bedeckt.
Erstellen Sie eine feuchte Kammer mit einer Pipettenspitzenbox mit Feuchttüchern oder Papiertüchern, die mit überschüssiger Hybridisierungslösung oder PBS getränkt wurden, um Feuchtigkeit zu erzeugen. Inkubieren Sie den Objektträger in der feuchten Kammer bei 45 bis 50 Grad Celsius für mindestens drei Stunden, abhängig von der Sonde, die die Verdunstung reduziert. Entferne die Plastikdeckdeckel und brüte die Objektträger in einem FISH-Waschpuffer in einem Coplin-Glas, beide auf 50 Grad Celsius vorgewärmt.
Stellen Sie das Coplin-Glas für 10 bis 20 Minuten zurück in den 50-Grad-Ofen. Entferne den FISH-Waschpuffer und ersetze ihn durch PBS im Coplin-Glas. Unmittelbar nach dem Nachfüllen des Coplin-Glases mit PBS dekantieren Sie das PBS.
Entfernen Sie die Objektträger aus dem Glas und pipettieren Sie die Gegenbefleckung auf dem gesamten Abschnitt, wobei Sie darauf achten, das Taschentuch mit der Pipettenspitze nicht zu berühren. Inkubiere bei 4 Grad Celsius für 45 Minuten. Wasche die Flecken dreimal schnell mit frischem PBS.
Wischen Sie die Rückseite der Objektträger mit einem Tuch oder Papiertuch ab und lassen Sie den Großteil des PBS von den Abschnitten verdampfen, unterstützt durch eine Vakuumleitung, die mit einer Pipettenspitze verbunden ist. Montiere die Abschnitte mit einem Montagemedium. Befestigen Sie die Deckblätter an der Folie, indem Sie entlang der Ränder des Deckblatts mit klarem Nagellack lackieren und dabei darauf achten, den Rand der Folie zu vermeiden. Lass es bei Zimmertemperatur stehen.