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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 4:02 Min. • February 2nd, 2026
Nehmen wir die gesamte RNA, die aus einem mit pathogenen Bakterien infizierten Maushirn extrahiert wurde. Der Extrakt enthält Transkripte von infektionsempfindlichen Genen.
Fügen Sie ein DNA-abbauendes Enzym hinzu und inkubieren Sie, um restliche genomische DNA abzubauen.
Fügen Sie eine Mastermischung hinzu, die Reverse-Transkriptase-(RT)-Enzym, Nukleotide und unspezifische Primer enthält.
Inkubieren, um komplementäre DNA (cDNA) zu synthetisieren.
Führe eine hohe Temperatur ein, um das RT-Enzym zu inaktivieren.
Nehmen Sie eine Mastermischung, die DNA-Polymerase, Nukleotide, einen doppelsträngigen DNA-bindenden Farbstoff und Primer enthält, die spezifisch für ein Zielgen sind.
Gib die cDNA hinzu und wende Hitze an, um die DNA zu denaturieren.
Der Primer bindet an die Ziel-cDNA und ermöglicht so die Synthese neuer DNA-Stränge.
Der Zyklus wird wiederholt, um das Zielgen zu amplifizieren.
Der Farbstoff bindet an die amplifizierte DNA und strahlt Fluoreszenz aus, die am Ende jedes Zyklus aufgezeichnet wird.
Ein Anstieg der Fluoreszenz bestätigt die Expression des infektionsresponsiven Gens im infizierten Maushirn.
Infizieren Sie alle Mäuse mit planktonischen Zellen oder Biofilm-Zustandszellen und führen Sie die Euthanasie wie im Textprotokoll beschrieben durch. Als Nächstes wird die gesamte RNA aus dem Hirngewebe mit einem RNA-Extraktionskit extrahiert.
Für jede Maus verwenden Sie ganzes Gehirngewebe zur RNA-Extraktion. Teile das gesamte Gehirngewebe in fünf Röhren. Nehmen Sie bis zu 100 Milligramm Hirngewebe und geben Sie jedem Rohr, das die vom Set bereitgestellte Lysematrix enthält, 1 Milliliter Lyselösung hinzu.
Extrahieren Sie die RNA gemäß den im Textprotokoll aufgeführten Schritten. Als Nächstes wird cDNA-Synthese durchgeführt, einschließlich der Eliminierung genomischer DNA, mit einem Thermocycler mit einem Reverse-Transkriptionsreagenz-Kit. Fügen Sie 1 Mikrogramm RNA zu einem Röhrchen hinzu, das 2 Mikroliter 5-fachen genomischen DNA-Eliminationspuffer und 1 Mikroliter genomisches DNA-Eliminationsenzym enthält.
Fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, bis das Volumen 10 Mikroliter erreicht. Inkubieren Sie 2 Minuten bei 42 Grad Celsius. Gib der Reaktionslösung 10 Mikroliter Mastermischung hinzu und rühre dann vorsichtig.
Beginnen Sie sofort mit der Reverse-Transkriptionsreaktion, indem Sie das Rohr für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius platzieren. Dann wird die Reaktion für 5 Sekunden auf 85 Grad Celsius übertragen. Führen Sie die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse mit einer Echtzeit-PCR-Maschine mit einem cyber-quantitativen Echtzeit-PCR-Kit durch. Gemäß der Kit-Anleitung kombinieren Sie das Enzym, die Primer, 50x ROX Referenzfarbe zwei und die cDNA-Vorlage. Dann fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, bis ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern erreicht ist.
Führe jede Probe im Dreifachverfahren mit den im Textprotokoll aufgeführten thermischen Parametern aus und berechne die relative Faltänderung basierend auf der Zwei-minus Delta-Delta-CT-Methode.