Orale Infektion von Drosophila melanogaster mit pathogenen Bakterien

Nimm ein Fläschchen mit einem Deckel, das Nährstoffagar enthält, überlagert mit Filterpapier.

Tragen Sie eine Suspension pathogener Bakterien auf das Filterpapier auf.

Führe eine ausgehungerte Drosophila melanogaster-Fliege ins Fläschchen und setze dann den Deckel auf. Inkubieren, um die Nahrung zu ermöglichen und die Bakterienaufnahme sicherzustellen.

Die aufgenommenen Bakterien gelangen in den Darm und dringen durch die schützende Membran im Lumen ein.

Die Bakterien haften am darunterliegenden Epithel an, setzen Toxine frei, die Epithelschäden und Invasionen fördern, und besiedeln inneres Gewebe.

Tauchen Sie die Fliege in Alkohol, um oberflächenassoziierte Bakterien zu entfernen, und spülen Sie sie dann ab, um den Alkohol zu entfernen.

Fügen Sie einen Puffer hinzu und homogenisieren Sie die Fliege, um die inneren bakteriellen Inhalte freizusetzen.

Führen Sie serielle Verdünnungen des Homogenats in einer Mikroplatte durch. Als Nächstes wird die Verdünnung auf Nährstoffagar angelegt und bebrütet, um die Koloniebildung zu ermöglichen.

Zählen Sie die Kolonien, um die Anzahl der lebensfähigen Bakterienzellen zu bestimmen, die durch eine orale Infektion der Fliege entstehen.

Zwei bis vier Stunden vor der oralen Infektion werden die Fliegen in Standard-Agar-Phiolen ohne Nahrung übertragen. In der Zwischenzeit bereiten Sie für jede Fliege ein Infektionsfläschchen vor.

Zuerst füllen Sie den Deckel eines 7-Milliliter-Probetubes mit 500 Mikrolitern Standard-Zuckeragar und lassen Sie ihn fest werden. Als Nächstes steckt man eine Scheibe Filterpapier in den Agar. Dann pipettieren Sie 100 Mikroliter Bakterienkultur direkt auf die Filterscheibe. Als Kontrolle verwenden Sie 5 % Saccharosewasser.

Nach der Hungerzeit werden einzelne Fliegen in die vorbereiteten Röhren übertragen. Nach 18 bis 24 Stunden Inkubation der Fliegen wird die Fliegen an der Oberfläche sterilisiert. Füllen Sie Personen in ein Rohr mit 100 Mikrolitern 70 % Ethanol.

Nach 20 bis 30 Sekunden entfernen Sie das Ethanol und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter dreifach destilliertes Wasser. Nach weiteren 20 bis 30 Sekunden das Wasser entfernen. Dann 100 Mikroliter PBS hinzufügen und die Fliege homogenisieren.

Übertragen Sie das Homogenat auf die oberste Reihe einer 96-Well-Platte und fügen Sie 90 Mikroliter 1x PBS in jede darunterliegende Mulde hinzu. Anschließend wird diese Probe mit 10-Mikroliter-Aliquots seriell verdünnt, um einen Bereich von CFU-Werten zu unterscheiden. Als Nächstes verteile ich die seriellen Verdünnungen auf einer LB-Nähragarplatte in 5-Mikroliter-Tröpfchen.

Positionieren Sie die Tröpfchen so, dass sie unauffällig auf der Platte platziert sind. Dann brütet man die Platte über Nacht aus. Am nächsten Tag berechnet man die Anzahl der CFUs aus der Verdünnung, die 10 bis 60 deutlich sichtbare Kolonien erzeugt.