Co-Infiltrationstest zur Untersuchung von Erregereffektoren, die die Abschaltung von Pflanzen-RNA unterdrücken

Nehmen wir eine Mischung, die gleiche Volumina von zwei Agrobacterium tumefaciens-Suspensionen enthält, von denen jede ein Plasmid-Element enthält, das für GFP codiert, und das andere ein Effektorprotein.

Man durchsticht ein Loch und verwendet eine nadellose Spritze, um die Mischung in die Unterseite gesunder, vollständig expandierter Blätter von Nicotiana benthamiana 16c einzuschleusen.

Tupfen Sie überschüssige Suspension mit Weichgewebe ab, um ein bakterielles Überwachsen zu verhindern.

Markiere die unterwanderten Bereiche und brüte die Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen aus.

Agrobacterium überträgt die Plasmid-DNA in die Pflanzenzellen, wo die GFP- und Effektorgene in mRNAs transkribiert und in Proteine übersetzt werden.

Das Verteidigungssystem der Anlage verwendet RNA-Silencing, bei der Duplex-siRNAs in RISC geladen werden. Der Passagierstrang wird entfernt, und der Leitstrang lenkt den Komplex zum Abbau von Ziel-GFP-mRNA.

Die Effektorproteine binden jedoch an siRNAs, verhindern ihre Assoziation mit RISC und ermöglichen das Fortbestehen der GFP-Fluoreszenz.

Dies ermöglicht die Identifizierung von Erregereffektoren, die die RNA-Silencing von Pflanzen unterdrücken.

Mische gleiche Mengen einer Agrobacterium-Kultur mit 35S grünem fluoreszierendem Protein mit einer Agrobacterium-Kultur mit 35S Gurkenmosaikvirussuppressor 2b, vermutetem Effektor oder leerem Vektor. Mit einer 1-Milliliter-Nadelspritze wird vorsichtig und langsam die gemischten Agrobacterium-Suspensionen an den abaxialen Seiten von Nicotiana bethamiana 16c-Blättern infiltriert.

Entfernen Sie die verbleibende bakterielle Suspension von den Blättern mit Weichgewebetüchern und umrunden Sie die Ränder der infiltrierten Flecken mit einem Marker.