JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:29 Min. • February 2nd, 2026
Beginnen Sie mit transgenen Zebrafisch-Embryonen, die fluoreszierend markierte Makrophagen exprimieren, montiert in niedrigschmelzender Agarose in einer Bildgebungsschale.
Diese Embryonen werden mit fluoreszierend markiertem Mycobacterium marinum durch intramuskuläre Mikroinjektion in das Mittelhirn infiziert, wodurch eine lokale Immunantwort ausgelöst wird.
Bedecken Sie die verfestigte Agarose mit Embryonalmedien, die Anästhetika enthalten, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, sowie chemischen Inhibitoren zur Unterdrückung der Pigmentierung, um eine optische Klarheit für die Bildgebung zu gewährleisten.
Stellen Sie die Schale in die Umweltkammer eines hochauflösenden Konfokalmikroskops.
Mit hellem Feldlicht lokalisieren Sie die infizierte Region.
Aktivieren Sie die Fluoreszenzlaserkanäle, stellen Sie die Start- und Endpositionen des Z-Stacks ein und starten Sie die Zeitrafferbildgebung.
Stellen Sie sich das infizierte Makrophag vor, gefüllt mit fluoreszierenden Bakterien, während es rund und unbeweglich wird.
Dies deutet auf einen zytoskelettalen Zerfall und den Beginn des lytischen Zelltodes hin.
Im Laufe der Zeit schwillt und platzt der Makrophag, wobei zytoplasmatische Inhalte und internalisierte Bakterien in das umliegende Gewebe gelangen – ein Kennzeichen entzündlicher lytischer Zelltod.
Sobald die Agarose vollständig erstarrt ist, bedecken Sie die Agarose mit einer Schicht Eiwasser. Nachdem Sie die Umweltkammer aufgebaut haben, stellen Sie die 35-Millimeter-Glasbodenschüssel mit dem Zebrafisch in die Umweltkammer. Öffne die 405-Diode, Argon mit 20 % Leistung und DPSS 561 Nanometer-Laser. Richte die passende Laserleistung in den Spektrumeinstellungen ein.
Wählen Sie den "XYZ" "Sequential Scan"- Aufnahmemodus und stellen Sie das Bildformat auf "512 mal 512 Pixel" ein. Wechsel in den "Live Data Mode", ziele auf die Position des ersten Zebrafischs und markiere die Position "Begin" und "End" Z. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der verbleibenden Embryonen. Füge am Ende des Programms ein "Pause" hinzu. Definiere die Schleife und den Zyklus des Programms und speichere die Datei.