In-situ-Nachweis von Bakterien in Maus-Zahnfleischgewebeschnitten

Nehmen Sie einen Maus-Zahnfleischabschnitt, der mit pathogenen Bakterien infiziert ist und vorbehandelt wird, um auf bakterielle DNA zuzugreifen.

Legen Sie einen Puffer mit einer digoxigenin-markierten DNA-Sonde auf, die auf bakterielle DNA abzielt.

Legen Sie einen Überdeckzettel an und versiegeln Sie, um eine Enttrocknung der Probe zu verhindern.

Wärme einführen, um die DNA zu denaturieren, und dann unter heißen und feuchten Bedingungen inkubieren, um eine Sondenhybridisierung zu ermöglichen.

Kühlen Sie den Schlitten und entfernen Sie den Deckmantel und waschen Sie mehrmals mit Puffer, um ungebundene Sonden zu entfernen.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Inkubieren Sie mit enzymkonjugierten Antikörpern, die an das Digoxigenin binden.

Wasch, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie einen Inhibitor hinzu, um das endogene Enzym selektiv zu inaktivieren.

Trage ein Substrat auf, das mit dem Enzym reagiert, um einen gefärbten Niederschlag zu erzeugen.

Spülen Sie mit Wasser ab, um überschüssiges Substrat zu entfernen.

Fügen Sie einen Farbstoff hinzu, um die Kerne zu färben.

Waschen, um überschüssige Farbe zu entfernen.

In Ethanol dehydrieren und mit Xylol behandeln, um die Gewebetransparenz zu erhöhen.

Steig den Abschnitt auf.

Betrachten Sie unter dem Mikroskop die Bakterien im Schnitt.

Beginnen Sie mit dem In-situ-Erlebnis, indem Sie die Objektträger zunächst 20 Minuten lang in 2x SSC tauchen. Verdünnen Sie die beschriftete Sonde auf 1 Nanogramm pro Mikroliter im Hybridisierungspuffer. Für eine negative Kontrolle verwenden Sie das 10-fache der Konzentration einer nicht markierten Sonde. Dann denaturieren Sie die Sonden, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius erhitzen und anschließend schnell auf Eis abkühlen.

Als Nächstes wird auf jeden Objektträger das gleiche Volume der Sondenverdünnung angewendet wie auf die Proteinase K. Anschließend decken Sie die Slip-and-Seal-Bereiche sorgfältig mit Nagellack ab. Erhitze die Objektträger nun auf einem PCR-Maschinenblock bei 90 Grad Celsius für 10 Minuten und übertrage sie über Nacht in einen befeuchteten Inkubator bei 45 Grad Celsius.

Am nächsten Tag kühlen Sie die Objektträger für eine halbe Stunde bei 4 Grad Celsius ab und entfernen Sie dann vorsichtig die Deckel. Das Gewebe ist zerbrechlich. Führen Sie die Folien schließlich bei Raumtemperatur durch eine Reihe von SSC-Puffern.

Wasche die in situ hybridisierten Objektträger 5 Minuten lang in MABT. Anschließend tragen Sie 50 bis 400 Mikroliter Blocklösung in 1 % Tween 20 für 20 Minuten auf. Nach der Blockinkubation werden 50 bis 400 Mikroliter 1 bis 1000 Anti-DIG-Alkali-Phosphatase-Antikörper in Blocklösung aufgetragen.

Lass es 90 Minuten bei 37 Grad Celsius binden. Nachdem der Primär aufgetragen wurde, waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in MABT. Dann legst du die Objektträger für 5 Minuten in den Erkennungspuffer mit 1 % Tween 20.

Nun werden 50 bis 400 Mikroliter 1 millimolare Levamisol in einer Nachweispufferlösung auf jeden Objektträger aufgetragen und 5 Minuten lang inkubiert, um die endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren. Gib als Nächstes 50 bis 400 Mikroliter NBT/BCIP, verdünnt im Detektionspuffer bei 1 bis 100 Dosen, zu jedem Objektträger und lasse die Objektträger basierend auf Erfahrung 2 bis 3 Stunden in einer befeuchteten Kammer inkubieren.

Spüle die Objektträger mit DI-Wasser. Dann trage Methylgrün mit 0,05 % Volumengewicht auf und lass den Gegenstoff 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf das Gewebe wirken. Wasche die Objektträger erneut mit DI-Wasser und trockne sie dann mit 100 % Ethanol, gefolgt von einem Dip in Xylol. Zum Schluss tragen Sie 80 Mikroliter Montagemedium auf und schließen Sie die Objektträger ab.