Herstellung einer Agrobakterienkultur zur Genlieferung in Pflanzenzellen

Beginnen Sie mit einer Agrobacterium tumefaciens-Kultur , die in einem Medium mit zwei Antibiotika gezüchtet wird, um Kontaminationen zu verhindern und die Plasmidretention sicherzustellen.

Die Bakterien enthalten einen Pflanzenexpressionsvektor, der ein interessantes Gen und ein Antibiotikaresistenzgen trägt.

Sie enthalten außerdem ein Helferplasmid mit einer Region von Virulenzgenen, die für die Übertragung des interessanten Gens in Pflanzenzellen erforderlich sind.

Übertragen Sie einen Teil in ein Rohr, das ein gepuffertes Medium enthält, das mit Acetosyringon, einem pflanzlich abgeleiteten Signalmolekül, und den Antibiotika ergänzt wird. Inkubieren Sie mit Zittern.

Acetosyringon diffundiert in die Zelle, löst einen Signalweg aus und aktiviert die Expression der Virulenzgene, die für die Übertragung des interessierten Gens erforderlich sind.

Die Kultur übertragen, zentrifugieren, um die Bakterien zu sammeln, und das Supernatant entsorgen.

Fügen Sie einen Salzpuffer hinzu und waschen Sie die Zellen wiederholt, um die hinzugefügten Antibiotika zu entfernen.

Die Bakterien im Puffer mit Acetosyringon wieder aufhängen und ohne Schütteln inkubieren, um die Virulenzgenexpression aufrechtzuerhalten.

Nutzen Sie die Kultur sofort für eine effiziente Transformation.

Verwenden Sie einen Tipp, um eine positive Kolonie von der LB-Platte zu entnehmen und die Zellen in ein Glasrohr mit 5 Millilitern LB-Medium zu impfen, ergänzt mit 50 Mikrogramm Kanamycin pro Milliliter und 50 Mikrogramm Rifampicin pro Milliliter. Wachsen Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie bei 200 U/min für 24 bis 48 Stunden.

Transferiere 100 Mikroliter der Kultur in 5 Milliliter LB-Medium, ergänzt mit denselben Antibiotika, 10 millimolare MES bei pH 5,6 und 20 mikromolare AS. Ziehe die Bakterien bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min für 16 bis 20 Stunden an. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4.000-mal g für 10 Minuten. Verwerfen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 2 Millilitern 10 millimolaren Magnesiumchloridpuffer.

Wiederholen Sie die Reinigung, um die vollständige Entfernung der Antibiotika sicherzustellen. Bestimmen Sie die Dichte der Agrobacterium-Kultur , indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern messen. Stellen Sie die Zellkultur mit einem 10-millimolaren Magnesiumchloridpuffer auf einen OD₆₀₀ von 1,5 bis 2,0 an.

Fügen Sie 10 millimolare MES bei pH 5,6 und 150 mikromolare AS zur finalen Suspensionskultur hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur mindestens 3 Stunden ohne Schütteln.