Isolierung und Kultivierung von Bakterien aus Zebrafisch-Embryonen zur Einschätzung der Infektionslast

Nehmen wir einen Zebrafisch-Embryo, der mit Mycobacterium abscessus infiziert ist, einem pathogenen Bakterium, das das zentrale Nervensystem angreift und Abszesse bildet, die Bakterien und Wirts-Immunzellen enthalten.

Inkubieren Sie den Embryo auf Eis, um ihn zu immobilisieren, und setzen Sie ihn dann einer Überdosis Anästhetikum aus, um die Herz- und Nervenaktivität zu stoppen, was zum Tod führt.

Waschen Sie den Embryo, um die Restbetäubung zu entfernen.

Fügen Sie eine Reinigungslösung hinzu, um die Zellmembranen zu stören und den Embryo zu lysieren.

Schneiden Sie das Lysat mit einer Nadel, um das Gewebe zu homogenisieren und die Bakterien freizusetzen.

Zentrifugieren, das Überlagermittel entsorgen und das Pellet in einer Tensidlösung wieder aufhängen, um eine bakterielle Klumpung zu verhindern.

Verdünnen Sie die bakterielle Suspension reihenweise und verteilen Sie sie auf Agarplatten.

Das Medium wird mit Antibiotika ergänzt, um das Wachstum anderer Mikroben zu hemmen, während die Mycobacterium-Zellen , die für Antibiotikaresistenz konstruiert wurden, sich vermehren.

Inkubieren, um die Koloniebildung zu fördern und so die Quantifizierung der Bakterienlast des Embryos zu ermöglichen.

Um koloniebildende Einheiten oder CFUs zum gewünschten Zeitpunkt aufzuzählen, entnehmen Sie pro Infektionszustand fünf Embryonen und übertragen jeden Embryo in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Kryoanästhesieren Sie die Embryonen durch eine 10-minütige Inkubation auf Eis. Nach der Einschläferung der Embryonen mit 300 bis 500 Milligramm pro Liter Trikain werden die Embryonen zweimal in einem neuen Eileiter mit sterilem Wasser gewaschen.

Als Nächstes, nachdem Wasser mit 2 % Triton X-100 in 1 X PBS pro Embryo entfernt wurde, verwenden Sie eine 26-Gauge-Nadel, um das Gewebe für eine vollständige Lyse zu homogenisieren.

Nach der Zentrifugation der Suspension verwenden Sie 1x PBST, um das Pellet wieder aufzuhängen. Anschließend wurde die Plattenserialverdünnung der Homogenate auf Middlebrook 7H10O^ADC ergänzt mit BBL MGIT PANTA.

Brüten Sie die Platten 4 Tage lang bei 30 Grad Celsius aus, bevor Sie die Kolonien zählen.