Name: Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Lernen Sie die Präparation von SCN-Schnitten aus transgenen Mäusen und die organotypische Kultur zur kontinuierlichen Aufzeichnung von Clock-Gen-Aktivität mittels Luciferase-Reporter-Technologie.

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FONCICyT 000000000091984;; die Grundlagen der Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist und Sigurd och Elsa Diese Arbeit wurde von der schwedischen Medical Research Council (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3) finanziert Goljes Minne und schwedischen Society of Medicine SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, ist dankbar für die wertvollen Hinweise zum Manuskript anerkannt. Wir danken Dr. Michael Andäng und Dr. Helena Johard für die HCN-Kanal-Blocker, und Prof. Abdel El-Manira für die Bereitstellung von Video-Mikroskop. Ethische Überlegungen: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Karolinska Institutet und &quot;Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot; set durchgeführt. Alle Tierversuche werden mit der Absicht durchgeführt, um mögliche Belastungen oder Unbehagen, das Tier zu minimieren.

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Vorteile und Nachteile, die mit Luciferase-Reporter-Technologie Im Gegensatz zur Ex-vivo-Methoden, wie z. B. RT-PCR, in situ Hybridisierung und Western-Blot, dass Gewebeentnahme erfordert an vielen verschiedenen Zeitpunkten (was zu einem geringen zeitlichen Auflösung von in der Regel 2-4 Stunden je nach Sampling-Frequenz), um tägliche Studie Variationen in der Gen-und Protein-Ausdrücke erlaubt die Luciferase-Reporter-Technologie mit hoher Auflösung (1-10 min) Studien der circadianen Oszillationen für viele Tage in der gleichen Weise vor. So ist die Zahl der verwendeten Tiere auf ein Minimum reduziert und detaillierte Untersuchungen der Auswirkungen auf Phase und Zeit der Rhythmus sind möglich, was normalerweise nicht möglich ist mit konventionellen Sampling-Techniken mit geringer zeitlicher Auflösung. Doch obwohl relative Amplitude Messungen der Rhythmus möglich sind, sollte betont werden, dass Reporter Technologie nicht quantitative und kann daher nicht verwendet werden, um Mengen von transkribierten Gene oder Proteine ​​übersetzt messen werden. Das Gewebe Aufnahmen gestartet und ausgewertet werden sofort nach der Kultivierung, ein großer Vorteil für das direkte Studium der molekularen Effekte in vivo Stress in vivo lichtinduzierten Phasenverschiebungen etc. Die organotypischen SCN Kultur ermöglicht langfristig (Wochen) pharmakologische Manipulation von erwachsenen Gehirn Gewebe mit einer intakten reifen synaptischen Netzwerk und die Luciferase-Reporter-Technologie ermöglicht eine stabile Aufnahmen für viele Wochen. So macht das Gewebe nicht zu Neugeborenen oder frühen postnatalen werden, um gesunde Kulturen zu erhalten, und im Gegensatz zu den akuten Scheibe chronischen pharmakologischen Behandlungen durchgeführt werden können. Im Gegensatz zu Plasmid-reporter Transfektionen in Zellkulturen, die keine auf den Einbau von DNA in das Genom führen, werden die transgenen Luciferase-Tiermodellen (sowie Lenti-Virus Transfektionen) günstig, wenn epigenetische Veränderungen untersucht werden sollen. Es sollte in diesem Zusammenhang auch erwähnt werden, dass Lumineszenzbildgebung heute ist mit hochempfindlicher CCD-Kameras 11 möglich, so dass Aufnahmen auch in einzelnen SCN Neuronen (~ 6-10 um) und anderen Zelltypen, von den großen Labors Studium zirkadianen Rhythmen genutzt werden. Schließlich mehreren circadianen Ermittler verwenden häufig die Überwachung der molekularen Expression mit anderen Reportern, wie das Green Fluorescent Protein, um Clock-Gen / Protein-Oszillationen 16-19 studieren. Aspekte der Schichtdicke Die hier empfohlenen Dicken der SCN Scheibe (200-300 um) könnte reduziert oder erhöht werden, falls gewünscht. Doch obwohl das Gewebe verflacht auf der Membran nach ein paar Tagen in Kultur, ist es nicht empfehlenswert, 500 pm Dicke der zunächst Anschnitt überschreiten, um die Lebensfähigkeit der Gewebe 7 zu erhalten. Ein Stück dünner als 100 pm ist der Maschinen-und praktischen Gründen schwierig zu handhaben. Da der SCN Gewebe ist heterogen die Dicke der Scheibe kann die Phase der Luciferase Ausgangssignal auswirken, da die verschiedenen Regionen innerhalb des SCN (zum Beispiel den &quot;Kern&quot; gegenüber der &quot;Schale&quot; und dorsal gegenüber ventralen Regionen) mit unterschiedlichen Phasen oszillieren 20 und differentiell nach Phase re-synchronisieren verschiebt 21. Die Dicke der Scheibe wirkt sich auch auf die Grundlinie der Photonenzahl seit mehr Gewebe gibt eine größere Anzahl von Photonen. Die Amplitude des molekularen Schwingungen können auf diese Weise indirekt von der Größe der Explantation betroffen sein. Aus diesen Gründen sollte die Kontrolle und behandelten Kulturen immer die gleiche Größe, Dicke und mit der gleichen Region des SCN, um in der gleichen Phase und mit gleicher Amplitude schwingen. Die beiden einseitigen Kerne, auf der anderen Seite, in Phase schwingen miteinander und mit ähnlichen Amplituden, solange die Vibratom Schnitt ist horizontal und nicht abgewinkelt (die wiederum abhängig ist, dass die Trennung zwischen Kleinhirn und den beiden Hemisphären Schnitt senkrecht auf die Tischoberfläche). Ein Ermittler, der SCN Kultivierung führt möglicherweise zu, dass SCN Kulturen nicht in Phase schwingen miteinander. Üben und Standardisierung der Slicing-Technik, dh die Scheiben sind immer an der gleichen rostro-kaudal des SCN schneiden, wird das Ergebnis verbessern. Kritische Schritte <ol><li> Sauerstoffversorgung ist kritisch. Weil das Gehirn braucht viel Sauerstoff 22, muss das Aufschneiden Verfahren schnell zu sein (Je näher 3,1-3,10 ist auf ~ 5-6 Minuten desto besser ist es in Ordnung zu halten das Gewebe gesund ist). </li><li> Der SCN ist empfindlich gegen Temperaturschwankungen und mittlere auszutauschen. Der SCN ist temperaturempfindlich und großen Temperaturschwankungen können Phasenverschiebung der Herzschrittmacher und verursachen experimentelle Artefakte 23. Wenn mittel-oder Lösungen ausgetauscht werden oder während eines laufenden Experiments, zum Beispiel bei der Anwendung eines Arzneimittels nach ein paar Tagen in Kultur, mittel-oder solutio hinzugefügtn muss vorgewärmt auf 36-37 ° C (die gleiche Temperatur wie in der Kammer) vor der Zugabe werden. In pharmakologischen Experimenten, die mittel-Austausch beteiligen, ist es wichtig, immer mit konditionierten Zellkulturmedium Arbeit. Addition / Wash-out mit frischen, können unbedingte Medium potentiell Phasenverschiebung der molekularen SCN Rhythmus 24 sowie anderen Zelltyp Kulturen 25. </li><li> Medium Zusammensetzung. Es ist wichtig, die Kultur des Gewebes in der richtigen pH-Wert und Osmolalität. Die Luft-Buffering Medium enthält eine große Menge von HEPES, die eine optimale Pufferkapazität im Bereich von pH 6,8 bis 8,2 hat und eignet sich auch für die Pufferung der pH-Änderungen, die als Folge der Zellatmung entstehen können. HEPES, auf der anderen Seite, ist empfindlicher auf Temperaturänderungen als mit Natriumbicarbonat, die in kleinen Mengen in das Kulturmedium enthalten ist verglichen. Natriumbicarbonat hat eine größere Pufferkapazität in den unteren pH-Wert (5,1-7,1)-Bereich 26, also gegebenenfalls in einem CO 2-Atmosphäre. Allerdings erhöhte Mengen von Natriumbicarbonat in der Luft-Buffering Medium (DMEM 2902) erhöht sich die Osmolalität erheblich und kann nicht ohne gleichzeitig Verdünnung des Mediums, was wiederum in die falsche Zusammensetzung der Aminosäuren, Vitaminen und Ionen. Hinzugefügt werden Beratung für die Vorbereitung des Mediums: <ol><li> Seien Sie präzise und vorsichtig beim Mischen des Mediums. </li><li> Verwenden Sie nur frisches oder frisch aufgetaut Stammlösungen. </li><li> Bei sehr hohen Osmolalität ist es nicht wert, Verdünnung. Mehr als 5-6% verdünnten Medium wird wahrscheinlich nicht funktionieren. Verwenden Sie D-Glucose zu Osmolalität erhöhen, wenn sie zu niedrig ist. </li></ol></li><li> Phasenverschiebungen aufgrund Vorbereitungszeit Die Zeit der Scheibe ist von kritischer Bedeutung. Null oder nur minimale Auswirkungen auf Phase ist erreicht, wenn die Scheibe Verfahren zwischen ZT 06-12 Dezember durchgeführt wird. Alle Scheiben Dissektionen sollte bei der gleichen Phase des tageszeitlichen oder circadianen Zyklus durchgeführt werden, um Fehler aufgrund von Abweichungen zwischen der Vorbereitungsphase zu minimieren. </li></ol> Mögliche Änderungen <ol><li> Bei akuten SCN Elektrophysiologie, hat das Schneiden mit einem Ringer (Artificial Cerebro Rückenmarksflüssigkeit; ACSF) durchgeführt werden Puffer, mit Sauerstoff (95% O 2, 5% CO 2) vor dem Schneiden beginnt gesättigt. Darüber hinaus braucht Sauerstoff, kontinuierlich in den Puffer hinzugefügt werden während der gesamten Slicing Verfahren, wie die Elektro-und synaptische Aktivität ist direkt abhängig von Sauerstoff-Versorgung 22. </li><li> Horizontal und sagittalen Schnitten können auch erfolgreich vorbereitet und kultivierten des SCN. Die Autoren haben Erfahrung mit Luciferase-Aufnahmen in horizontale Schnitte, die nach unseren Erfahrungen geben circadianen Oszillationen mit niedriger Amplitude, wie mit dem koronalen Schnitt verglichen. </li><li> Der SCN ist etwa 1 mm langen rostro-kaudal und das Schneiden hier beschriebene Technik ist auf den Erwerb eines SCN Abschnitt in der zentralen Region ausgerichtet. Allerdings kann mehr als eine SCN Abschnitt von Maus und Ratte Gehirn gewonnen werden, so dass die Untersuchung der circadianen Gen / Protein-Expression in mehr rostral gegen kaudalen Ebenen des SCN Kern. </li><li> Slice-Kulturen von jüngeren Tieren, postnatale Welpen oder auch Embryonen, können ebenfalls hergestellt werden. Bitte beachten Sie, dass das Gehirn und dem Schädel in sehr jungen Welpen sehr weich und empfindlich sind. Darüber hinaus ist der Sehnerv dünn und nicht voll entwickelt. Seien Sie vorsichtig beim Sezieren des Gehirns der Jungtiere, so dass die SCN Region nicht beschädigt wird. Zum Beispiel kann micro Rongeur Werkzeuge nicht verwendet werden, um den Schädel des Jungen Maus geöffnet werden, weil sie zu groß sind. Feine Schere genug sind, um die Weichteile in jungen Welpen geschnitten. </li><li> Das Deckglas auf Kultur hier beschriebene Technik kann auch zum Bild Lumineszenz mit einer CCD-/ EM-CCD-Kamera, auch in einzelnen SCN Neuronen verwendet werden. </li><li> Andere zentrale Nervensystem Regionen und periphere Organgewebe aus transgenen PER2:: LUC Tiere können leicht zu erhalten, kultiviert und im Hinblick auf die molekularen Schwingungen analysiert, wie die PER2:: LUC Ausdruck weiterhin für viele Tage auch oszillieren in einer Reihe anderer Gewebe und Zell-Typen 10. Die meisten dieser peripheren Geweben, zum Beispiel Leber, benötigen keine Membran für das Überleben, sondern werden gezüchtet direkt in das Medium 11 getaucht. Bitte beachten Sie, dass Phasenverschiebung durch Schneiden, Kultivierung und mittlere Austausch kann nicht nach den gleichen Grundsätzen wie bei SCN. </li></ol> Bedeutung In transgenen Mäusen und Ratten-Stämme (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) Luciferase-Enzymaktivität spiegelt Protein oder Genexpression Rhythmen und kann durch Biolumineszenz Aufnahme beurteilt werden. Die Luciferase-generated Biolumineszenz gibt ein schwaches Signal, aber der Hintergrund Lumineszenz ist nahe Null, so dass diese Methode von Vorteil. Darüber hinaus, da die Luciferase-Molekül instabil und schnell abgebaut wird es keinen phOtotoxizität, die während einer langfristigen erregenden Beleuchtung 28 angezeigt werden können. Zusammengenommen ermöglichen diese Eigenschaften dauerhaft Experimente machen die Luciferase-Reporter-Technologie sehr vorteilhaft in circadianen Forschung.

<table><tbody><tr><td>B27-Zusatz 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>Kulturschalen</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0,4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM mit niedrigem Glukosegehalt ohne Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>Pulver für 1 L</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>Filtrationsset</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Porengröße 0,22 &amp;#x03BC;m Polyethersulfon</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumont #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7,5 %</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>Beetle-Luciferin, Kaliumsalz</td></tr><tr><td>Kleiner Rongeur</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10.000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Petri-Schalen</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Skalpelle</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>Größe 11</td></tr><tr><td>Vakuumfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

slice-vorbereitung, organotypische gewebekulturen und luciferase aufzeichnung von clock gen-aktivität in den nucleus suprachiasmaticus

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Eine zentrale circadiane (~ 24 Std.) Uhr koordinierende Tagesrhythmus in Physiologie und Verhalten liegt in der suprachiasmatischen Nukleus (SCN) im vorderen Hypothalamus. Die Uhr ist direkt durch Licht über die Netzhaut und Sehnerv synchronisiert. Circadian Schwingungen werden durch die Interaktion negativen Feedback-Schleifen einer Reihe von sogenannten &quot;Clock-Gene&quot; und ihrer Eiweiss-Produkte, einschließlich der für den Zeitraum (pro-) Gene generiert. Die Core-Taktfrequenz ist auch abhängig von Membrandepolarisation, Kalzium und cAMP 1. Der SCN zeigt täglichen Schwankungen in Takt Genexpression, Stoffwechsel und spontane elektrische Aktivität. Bemerkenswert ist, besteht diese endogene zyklische Aktivität in adulten Geweben Scheiben des SCN 2-4. Auf diese Weise kann die biologische Uhr einfach in vitro untersucht werden, so dass molekulare, elektrophysiologischen und metabolischen Untersuchungen der Schrittmacherfunktion. Der SCN ist eine kleine, gut definierte bilaterale Struktur direkt über dem Chiasma 5 befindet. In der Ratte enthält ~ 8.000 Neuronen in jeder Kern und hat Abmessungen von ca. 947 mu m (Länge, rostrokaudalen Achse) x 424 um (Breite) x 390 um (Höhe) 6. Um sezieren die SCN ist es notwendig, einen Hirnschnitt auf der jeweiligen Ebene des Gehirns, wo die SCN identifiziert werden können geschnitten. Hier beschreiben wir die Zerlegung und Slicing Verfahren des SCN, die ähnlich für Maus und Ratte Gehirn ist. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Kultur der sezierten Gewebes organotypically auf einer Membran 7, eine Technik für die SCN Gewebekultur von Yamazaki et al. 8. Schließlich zeigen wir, wie transgene Gewebe zur Messung Ausdruck der Uhren-Gene / Proteine ​​mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie, einer Methode, die ursprünglich für circadiane Messungen Geusz et al verwendet wurde. 9 verwendet werden kann. Wir verwenden hier SCN Gewebe aus den transgenen Knock-in Periode2: LUCIFERASE Mäusen durch Yoo et al 10.. Die Mäuse enthalten ein Fusionsprotein aus PERIOD (PER) 2 und die Glühwürmchen-Enzym Luciferase. Wenn PER2 in der Gegenwart des Substrats für die Luciferase, dh Luciferin übersetzt wird, kann die PER2 Ausdruck als Biolumineszenz überwacht werden, wenn Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin. Die Anzahl der emittierten Photonen positiv korreliert mit der Menge des produzierten PER2 Protein, und die Biolumineszenz-Rhythmen passen die PER2 Protein Rhythmus in vivo 10. Auf diese Weise den zyklischen Schwankungen in PER2 Ausdruck kann kontinuierlich überwacht werden Echtzeit während viele Tage. Das Protokoll folgen wir für Gewebekulturen und real-time Biolumineszenz Aufnahme wurde eingehend von Yamazaki und Takahashi 11 beschrieben.

Das Verfahren zur Herstellung von Scheiben mit der adulten Maus Hypothalamus suprachiasmatischen Nukleus (SCN), und einen schnellen Weg zur Kultur der SCN Gewebe in organotypischen Kultur Zustand, gemeldet werden. Darüber hinaus ist die Messung der oszillatorischen Uhr-Gen-Protein-Expression mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie beschrieben.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

Eine zentrale circadiane (~24 Std.) Uhr, die tägliche Rhythmen in der Physiologie und im Verhalten koordiniert, befindet sich im Nucleus suprachiasmaticus (SCN), der im ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie der suprachiasmatische Kern aus transgenen Mäusen geschnitten und präpariert wird, und wie das schematische Gewebe kultiviert wird, um die Expression von Uhrgenen oder -proteinen als durch Lumineszenz induzierte Luciferase zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einer transgenen Maus, die einen Luciferase-Reporter für ein Uhrgen oder -protein enthält, präpariert und anschließend eine Gehirnschnittpräparation, die den suprachiasmatischen Kern enthält, hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die kleinen bilateralen schematischen Kerne aus dem Schnittpräparat zu isolieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den schematischen Kernexplan auf einer Membran in einer Petrischale zu kultivieren, die Kulturmedium und Luciferian enthält. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Aufzeichnung der Luciferase-Aktivität durch Messung der Biolumineszenz mit Photomultiplierröhren in einer lichtdichten, beheizten Kammer. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die circadiane Oszillation des Clock-Gens oder des Clock-Proteins zeigen.Mein Name ist Sergey IV und ich arbeite bei Gabrielle Re Club. Mein Name ist SoFi Johansson und ich arbeite im Team von Gabriella. Mein Name ist Gabriel Quist.Ich bin leitende Wissenschaftlerin an der Abteilung für Neurowissenschaften, und mein Name ist Ka LaShon, und ich bin Doktorandin am Schwedischen medizinischen Zentrum für Neurowissenschaften, und ich arbeite mit Gabriella zusammen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Western Blot, RT-PCR und der in-situ-Hybridisierung besteht darin, dass die Expression eines Uhrgens oder -proteins kontinuierlich über mehrere Tage hinweg im selben Gewebe mit einer sehr hohen Auflösung von etwa einer Minute verfolgt werden kann, was eine detaillierte Analyse von Periode, Amplitude und Phase des circadianen Rhythmus ermöglicht. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zum Schneiden und Präparieren der SCN schwer zu erlernen sind.Das SEN ist sehr klein und kann schwer zu identifizieren sein. Die Durchführung des Verfahrens wird Dr. Sge Velia, eine Postdoktorandin in meinem Forschungsteam, demonstrieren. Nachdem die notwendigen Lösungen hergestellt wurden, bereiten Sie die für das Experiment verwendeten Petrischalen mit einer fünf Milliliter-Spritze vor, die mit Autoklav-Vakuumfett vorgefüllt ist.Tragen Sie das Fett auf die obere Ringfläche einer 35-Millimeter-Petrischale auf. Bereiten Sie für jede Schnittstelle eine separate Petrischale vor. Kultur. Füllen Sie ein Falcon-Röhrchen mit 10 Millilitern Luft, gepuffertem Kulturmedium.Dies ergibt ausreichend Medium für acht Kulturen. Geben Sie 10 Mikroliter frisch aufgetauten Luciferin zu. Luciferin ist lichtempfindlich, schützen Sie das Luciferin-haltige Medium daher vor Licht, indem Sie das Falcon-Röhrchen in einer dunklen Heizkammer bei 37 Grad Celsius aufbewahren.Als Nächstes sterilisieren Sie alle Instrumente, Deckgläser und sonstiges Material, das im Verfahren verwendet wird. Besprühen Sie alle nicht sterilen Geräte mit 70 % Ethanol. Belichten Sie die Instrumente und die gefetteten Petrischalen mindestens 30 Minuten lang einer UV-Strahlung in einer sterilen Haube. Ein weiterer Vorbereitungsschritt besteht darin, den Vibratom einzurichten und eine sterile Rasierklinge anzubringen. Die Ausrüstung ist nun für den chirurgischen Eingriff bereit. Nachdem eine Maus anästhesiert und enthauptet wurde, entfernen Sie mit einer Schere die Augen aus dem Kopf.Dies verhindert die Reizung oder Aktivierung der Sehnerven, wodurch Schäden am Nucleus suprachiasmaticus oder SCN vermieden werden. Entfernen Sie mit einer feinen Schere die letzte Halswirbelkörper und die Haut. Führen Sie zwei Schnitte im Schädelknochen entlang beider Seiten des Schädels durch, um so einen abnehmbaren Deckel zu erzeugen.Öffnen Sie den Schädel mit einem mikroskopischen Ron Jre-Tool. Verwenden Sie das RJ mit einer Aufwärtsbewegung und drücken Sie niemals mit dem Instrument auf das Gehirn. Um Schäden am SCN-Knötchen zu vermeiden, entfernen Sie sämtliches Knochenmaterial, bis die Riechkolben sichtbar sind.Verwenden Sie eine feine mikrochirurgische Feder-Schere, um vorsichtig durch den Sehnerv zwischen den Hemisphären und den Riechkugeln zu schneiden. Bitte. Eine Petrischale, gefüllt mit 50 bis 100 Milliliter kaltem HBSS, unter den Kopf der Maus stellen. Drehen Sie den Kopf um und lassen Sie das intakte Gehirn langsam herausrutschen.Schneiden Sie bei Bedarf die anderen Hirnnerven auf der gegenüberliegenden Seite des Sehnervs durch. Sobald das Gehirn gelöst ist, fällt es in die Petrischale, wodurch das Gehirn rasch abgekühlt wird. Verwenden Sie einen Löffel, um das eiskalte Gehirn auf eine sterile Schneideoberfläche zu übertragen, beispielsweise den umgedrehten Deckel einer Glas-Petrischale.Entfernen Sie das Kleinhirn, indem Sie mit sterilen Rasierklingen einen senkrechten Schnitt zwischen den Hemisphären und dem Kleinhirn durchführen. Tragen Sie Sekundenkleber auf die trockene Plattform des Vioms auf. Führen Sie eine scharfe gebogene Pinzette in den rostralen Teil des Gehirns ein und heben Sie das Gehirn an, wobei Sie es mit der Pinzette festhalten.Trocknen Sie das HBSS vorsichtig auf steriler Filterpapier ab. Befestigen Sie die Hemisphären mit der rostralen Spitze nach oben und der ventralen Fläche nahe der Schneidklinge auf dem Kleber der Plattform. Bringen Sie die Plattform im Vibratom-Halter an und füllen Sie diese sofort mit kaltem HBSS. Wenn der senkrechte Schnitt korrekt ausgeführt wird, sollten die Hemisphären aufrecht stehen. Ziel ist es, koronare Schnitte anzufertigen, die den mittleren Bereich des bilateralen SCN enthalten, und dabei die maximale Geschwindigkeit des Vibratoms zu verwenden. Beginnen Sie damit, 500 bis 800 Mikrometer dicke Abschnitte der Hemisphären abzuschneiden, bis die Kommissur erreicht ist. Beobachten.Während sich das Sehnervenkreuz verbreitert und die Schnitte auf eine Dicke von 100 Mikrometern reduziert werden, fortfahren, in Richtung des Coddle weiterzuschneiden und die horizontale manuelle Bewegung der Klinge verlangsamen, bis die beiden sSCN-Kerne erscheinen. Verwenden Sie gegebenenfalls eine Lupe, um die Kerne sichtbar zu machen, sobald die Ebene des SCN erreicht ist. Schneiden Sie einen SCN-Abschnitt von 250 Mikrometern. Füllen Sie einen Deckel eines mittelgroßen Petrischalen mit kaltem HBSS unter Verwendung eines weichen Pinsels. Heben und übertragen Sie den SCN-Hirnschnitt auf die Petrischale. Stellen Sie die Petrischale unter ein Stereomikroskop.Der nächste Schritt besteht darin, den SCN aus dem Schnitt zu isolieren. Überprüfen Sie mithilfe des Mikroskops, ob der bilaterale SCN auf mindestens einer Seite des Schnitts deutlich sichtbar ist. Verwenden Sie ein Paar steriler Skalpelle, um ein Gewebestück in Form eines Quadrats mit einer Kantenlänge von etwa 1,5 Millimetern herauszuschneiden, das beide SCNs enthält.Schneiden Sie so nah wie möglich am Nucleus suprachiasmaticus (SCN). Ohne das SCN-Gewebe zu entfernen, muss ein kleines Stück des Sehnervs am Explantat angeheftet bleiben, jedoch sollten keine anderen Kerne einbezogen werden. Schneiden Sie das Gewebe, das die bilateralen SCN enthält, der Länge nach durch, um zwei unilaterale SCN zu erhalten.Ein einseitiges SCN kann als Kontrolle in einer sterilen Haube verwendet werden. Im abgedunkelten Zustand 1200 Mikroliter des Lucifer-Mediums einer Petrischale mit 35 Millimeter Durchmesser hinzufügen und anschließend eine Kulturmembra auf die Flüssigkeitsoberfläche legen. Sicherstellen, dass sich keine Luftblasen unter der Membran befinden.Die Implantate sind winzig und schwer aufzuheben. Verwenden Sie daher eine 1000-Mikroliter-Pipette mit Spitze, um das SEN-Explant in die Spitze aufzusaugen, und drücken Sie es auf die Kulturmembra n. Entsorgen Sie überschüssiges HBSS und geben Sie für die Luciferase-Aufzeichnung nur ein einzelnes SEN pro Petrischale.Versiegeln Sie die Fett-Petri-Schale mit einer Deckglasplatte mit einem Durchmesser von 40 Millimetern. Geben Sie bei Bedarf weiteres Fett hinzu, falls die Abdichtung nicht dicht ist. Überführen Sie die Petri-Schalen in eine Aluma-Cycle-Vorrichtung, die in einer lichtundurchlässigen Heizkammer bei 36 bis 37 Grad Celsius platziert ist.Um mit der Kultivierung zu beginnen, beachten Sie die Kulturschalen und die Photomultiplier-Röhren-Detektoranordnungen, die im Inneren der Lumineszenz-Kammer montiert sind. Platzieren Sie die Kulturschalen etwa ein bis zwei Zentimeter unterhalb der Photomultiplier-Röhren. Die Photomultiplier-Röhren detektieren und verstärken die durch Lumineszenz induzierte Luciferase.Das Software-Tool Luma Cycle wird zur Datenerfassung verwendet. Photonenzählungen werden über Intervalle von einer bis zehn Minuten integriert, um eine hohe Auflösung der Gen-Protein-Expression zu erzielen. Die circadiane Expression des Genproteins wird analysiert, um Phase, Periode und Amplitude des Rhythmus zu bestimmen.Diese Abbildung zeigt Biolumineszenzaufnahmen von gesunden und nicht gesunden SCN-Gewebekulturen. Diese Mäuse wurden vor der Entnahme ihres SCN-Gewebes unter einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gehalten. Die schwarze Linie zeigt den circadianen Rhythmus der Biolumineszenzaufnahmen der Expression von Period2-Luciferase.In einer gesunden SEN-Scheibe oszilliert das Protein mit der circadianen Variation, wobei die maximale Expression des Proteins zur Zeigerzeit 12 bis 13 oder zum Beginn der Dunkelheit auftritt. Somit hängt die Phase des Genrhythmus von dem Hell-Dunkel-Zeitplan ab, unter dem das Tier vor der Tötung gehalten wurde. Die blaue Linie zeigt Biolumineszenzaufnahmen aus einer SE- und Kultur, die nach dem Öffnen der Kulturschale am vierten Tag – wie durch den Pfeil angegeben – austrocknete, da sie nicht ordnungsgemäß wiederversiegelt wurde.Die rote Linie zeigt Biolumineszenz-Aufnahmen aus einer nicht gesunden SCN-Kultur. Diese Abbildung verwendet die SCN-Kultur in einem pharmakologischen Experiment. Die Abbildung zeigt eine Spur aus einer Kultur, die zum Zeitpunkt, der durch den ersten Pfeil angegeben ist, mit einem HCN-Ionenkanal-Blocker behandelt wurde.Über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen verringerte der Ionenkanalblocker die circadiane Oszillation und stoppte sie dann beim zweiten Pfeil. Die Substanz wurde ausgewaschen und durch ein konditioniertes Kontrollmedium ersetzt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, schnell, aber sorgfältig zu arbeiten, um die Vitalität des SEN-Gewebes aufrechtzuerhalten.Es ist außerdem wichtig, Ihren Vibram-Schnittprozess zu standardisieren, um jedes Mal die gleiche Ebene des SEN zu erhalten. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die SEN-Kultur und das SCN-Organ, typischerweise auf einer Membran, präpariert und die Expression von Clock-Genen oder Proteinen als durch Lumineszenz induzierte Luciferase in den Kulturen überwacht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Source: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Fluoreszenz-Live-Bildgebung mit Einzelzellauflösung von Drosophila Zirkadiane Uhren in der Larven-Gehirnkultur. &lt;span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;(2018). Dieses Video zeigt das Verfahren zum Einbetten der Drosophila Gehirn in einer Fibrinmatrix, gefolgt von einer...

Einbettung des Drosophila-Gehirns in eine Matrix für die Zeitraffer-Bildgebung der Neuronen der zirkadianen Uhr

Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Dieser Bericht beschreibt eine Methode, bei der ein R-Skript in der Open-Source-Software RStudio verwendet wird, um großräumige Datensätze zu analysieren, die aus Zeitreihenexperimenten gewonnen wurden.

Eine benutzerfreundliche und leistungsstarke R-Analyse von großräumigen Datensätzen

Lernen Sie die Präparation von SCN-Schnitten aus transgenen Mäusen und die organotypische Kultur zur kontinuierlichen Aufzeichnung von Clock-Gen-Aktivität mittels Luciferase-Reporter-Technologie.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus (Video) | JoVE Journal

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

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