Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie der suprachiasmatische Kern aus transgenen Mäusen geschnitten und präpariert wird, und wie das schematische Gewebe kultiviert wird, um die Expression von Uhrgenen oder -proteinen als durch Lumineszenz induzierte Luciferase zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einer transgenen Maus, die einen Luciferase-Reporter für ein Uhrgen oder -protein enthält, präpariert und anschließend eine Gehirnschnittpräparation, die den suprachiasmatischen Kern enthält, hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die kleinen bilateralen schematischen Kerne aus dem Schnittpräparat zu isolieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den schematischen Kernexplan auf einer Membran in einer Petrischale zu kultivieren, die Kulturmedium und Luciferian enthält. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Aufzeichnung der Luciferase-Aktivität durch Messung der Biolumineszenz mit Photomultiplierröhren in einer lichtdichten, beheizten Kammer. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die circadiane Oszillation des Clock-Gens oder des Clock-Proteins zeigen.

Mein Name ist Sergey IV und ich arbeite bei Gabrielle Re Club. Mein Name ist SoFi Johansson und ich arbeite im Team von Gabriella. Mein Name ist Gabriel Quist.

Ich bin leitende Wissenschaftlerin an der Abteilung für Neurowissenschaften, und mein Name ist Ka LaShon, und ich bin Doktorandin am Schwedischen medizinischen Zentrum für Neurowissenschaften, und ich arbeite mit Gabriella zusammen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Western Blot, RT-PCR und der in-situ-Hybridisierung besteht darin, dass die Expression eines Uhrgens oder -proteins kontinuierlich über mehrere Tage hinweg im selben Gewebe mit einer sehr hohen Auflösung von etwa einer Minute verfolgt werden kann, was eine detaillierte Analyse von Periode, Amplitude und Phase des circadianen Rhythmus ermöglicht. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zum Schneiden und Präparieren der SCN schwer zu erlernen sind.

Das SEN ist sehr klein und kann schwer zu identifizieren sein. Die Durchführung des Verfahrens wird Dr. Sge Velia, eine Postdoktorandin in meinem Forschungsteam, demonstrieren. Nachdem die notwendigen Lösungen hergestellt wurden, bereiten Sie die für das Experiment verwendeten Petrischalen mit einer fünf Milliliter-Spritze vor, die mit Autoklav-Vakuumfett vorgefüllt ist.

Tragen Sie das Fett auf die obere Ringfläche einer 35-Millimeter-Petrischale auf. Bereiten Sie für jede Schnittstelle eine separate Petrischale vor. Kultur. Füllen Sie ein Falcon-Röhrchen mit 10 Millilitern Luft, gepuffertem Kulturmedium.

Dies ergibt ausreichend Medium für acht Kulturen. Geben Sie 10 Mikroliter frisch aufgetauten Luciferin zu. Luciferin ist lichtempfindlich, schützen Sie das Luciferin-haltige Medium daher vor Licht, indem Sie das Falcon-Röhrchen in einer dunklen Heizkammer bei 37 Grad Celsius aufbewahren.

Als Nächstes sterilisieren Sie alle Instrumente, Deckgläser und sonstiges Material, das im Verfahren verwendet wird. Besprühen Sie alle nicht sterilen Geräte mit 70 % Ethanol. Belichten Sie die Instrumente und die gefetteten Petrischalen mindestens 30 Minuten lang einer UV-Strahlung in einer sterilen Haube.

Ein weiterer Vorbereitungsschritt besteht darin, den Vibratom einzurichten und eine sterile Rasierklinge anzubringen. Die Ausrüstung ist nun für den chirurgischen Eingriff bereit. Nachdem eine Maus anästhesiert und enthauptet wurde, entfernen Sie mit einer Schere die Augen aus dem Kopf.

Dies verhindert die Reizung oder Aktivierung der Sehnerven, wodurch Schäden am Nucleus suprachiasmaticus oder SCN vermieden werden. Entfernen Sie mit einer feinen Schere die letzte Halswirbelkörper und die Haut. Führen Sie zwei Schnitte im Schädelknochen entlang beider Seiten des Schädels durch, um so einen abnehmbaren Deckel zu erzeugen.

Öffnen Sie den Schädel mit einem mikroskopischen Ron Jre-Tool. Verwenden Sie das RJ mit einer Aufwärtsbewegung und drücken Sie niemals mit dem Instrument auf das Gehirn. Um Schäden am SCN-Knötchen zu vermeiden, entfernen Sie sämtliches Knochenmaterial, bis die Riechkolben sichtbar sind.

Verwenden Sie eine feine mikrochirurgische Feder-Schere, um vorsichtig durch den Sehnerv zwischen den Hemisphären und den Riechkugeln zu schneiden. Bitte. Eine Petrischale, gefüllt mit 50 bis 100 Milliliter kaltem HBSS, unter den Kopf der Maus stellen. Drehen Sie den Kopf um und lassen Sie das intakte Gehirn langsam herausrutschen.

Schneiden Sie bei Bedarf die anderen Hirnnerven auf der gegenüberliegenden Seite des Sehnervs durch. Sobald das Gehirn gelöst ist, fällt es in die Petrischale, wodurch das Gehirn rasch abgekühlt wird. Verwenden Sie einen Löffel, um das eiskalte Gehirn auf eine sterile Schneideoberfläche zu übertragen, beispielsweise den umgedrehten Deckel einer Glas-Petrischale.

Entfernen Sie das Kleinhirn, indem Sie mit sterilen Rasierklingen einen senkrechten Schnitt zwischen den Hemisphären und dem Kleinhirn durchführen. Tragen Sie Sekundenkleber auf die trockene Plattform des Vioms auf. Führen Sie eine scharfe gebogene Pinzette in den rostralen Teil des Gehirns ein und heben Sie das Gehirn an, wobei Sie es mit der Pinzette festhalten.

Trocknen Sie das HBSS vorsichtig auf steriler Filterpapier ab. Befestigen Sie die Hemisphären mit der rostralen Spitze nach oben und der ventralen Fläche nahe der Schneidklinge auf dem Kleber der Plattform. Bringen Sie die Plattform im Vibratom-Halter an und füllen Sie diese sofort mit kaltem HBSS.

Wenn der senkrechte Schnitt korrekt ausgeführt wird, sollten die Hemisphären aufrecht stehen. Ziel ist es, koronare Schnitte anzufertigen, die den mittleren Bereich des bilateralen SCN enthalten, und dabei die maximale Geschwindigkeit des Vibratoms zu verwenden. Beginnen Sie damit, 500 bis 800 Mikrometer dicke Abschnitte der Hemisphären abzuschneiden, bis die Kommissur erreicht ist. Beobachten.

Während sich das Sehnervenkreuz verbreitert und die Schnitte auf eine Dicke von 100 Mikrometern reduziert werden, fortfahren, in Richtung des Coddle weiterzuschneiden und die horizontale manuelle Bewegung der Klinge verlangsamen, bis die beiden sSCN-Kerne erscheinen. Verwenden Sie gegebenenfalls eine Lupe, um die Kerne sichtbar zu machen, sobald die Ebene des SCN erreicht ist. Schneiden Sie einen SCN-Abschnitt von 250 Mikrometern.

Füllen Sie einen Deckel eines mittelgroßen Petrischalen mit kaltem HBSS unter Verwendung eines weichen Pinsels. Heben und übertragen Sie den SCN-Hirnschnitt auf die Petrischale. Stellen Sie die Petrischale unter ein Stereomikroskop.

Der nächste Schritt besteht darin, den SCN aus dem Schnitt zu isolieren. Überprüfen Sie mithilfe des Mikroskops, ob der bilaterale SCN auf mindestens einer Seite des Schnitts deutlich sichtbar ist. Verwenden Sie ein Paar steriler Skalpelle, um ein Gewebestück in Form eines Quadrats mit einer Kantenlänge von etwa 1,5 Millimetern herauszuschneiden, das beide SCNs enthält.

Schneiden Sie so nah wie möglich am Nucleus suprachiasmaticus (SCN). Ohne das SCN-Gewebe zu entfernen, muss ein kleines Stück des Sehnervs am Explantat angeheftet bleiben, jedoch sollten keine anderen Kerne einbezogen werden. Schneiden Sie das Gewebe, das die bilateralen SCN enthält, der Länge nach durch, um zwei unilaterale SCN zu erhalten.

Ein einseitiges SCN kann als Kontrolle in einer sterilen Haube verwendet werden. Im abgedunkelten Zustand 1200 Mikroliter des Lucifer-Mediums einer Petrischale mit 35 Millimeter Durchmesser hinzufügen und anschließend eine Kulturmembra auf die Flüssigkeitsoberfläche legen. Sicherstellen, dass sich keine Luftblasen unter der Membran befinden.

Die Implantate sind winzig und schwer aufzuheben. Verwenden Sie daher eine 1000-Mikroliter-Pipette mit Spitze, um das SEN-Explant in die Spitze aufzusaugen, und drücken Sie es auf die Kulturmembra n. Entsorgen Sie überschüssiges HBSS und geben Sie für die Luciferase-Aufzeichnung nur ein einzelnes SEN pro Petrischale.

Versiegeln Sie die Fett-Petri-Schale mit einer Deckglasplatte mit einem Durchmesser von 40 Millimetern. Geben Sie bei Bedarf weiteres Fett hinzu, falls die Abdichtung nicht dicht ist. Überführen Sie die Petri-Schalen in eine Aluma-Cycle-Vorrichtung, die in einer lichtundurchlässigen Heizkammer bei 36 bis 37 Grad Celsius platziert ist.

Um mit der Kultivierung zu beginnen, beachten Sie die Kulturschalen und die Photomultiplier-Röhren-Detektoranordnungen, die im Inneren der Lumineszenz-Kammer montiert sind. Platzieren Sie die Kulturschalen etwa ein bis zwei Zentimeter unterhalb der Photomultiplier-Röhren. Die Photomultiplier-Röhren detektieren und verstärken die durch Lumineszenz induzierte Luciferase.

Das Software-Tool Luma Cycle wird zur Datenerfassung verwendet. Photonenzählungen werden über Intervalle von einer bis zehn Minuten integriert, um eine hohe Auflösung der Gen-Protein-Expression zu erzielen. Die circadiane Expression des Genproteins wird analysiert, um Phase, Periode und Amplitude des Rhythmus zu bestimmen.

Diese Abbildung zeigt Biolumineszenzaufnahmen von gesunden und nicht gesunden SCN-Gewebekulturen. Diese Mäuse wurden vor der Entnahme ihres SCN-Gewebes unter einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gehalten. Die schwarze Linie zeigt den circadianen Rhythmus der Biolumineszenzaufnahmen der Expression von Period2-Luciferase.

In einer gesunden SEN-Scheibe oszilliert das Protein mit der circadianen Variation, wobei die maximale Expression des Proteins zur Zeigerzeit 12 bis 13 oder zum Beginn der Dunkelheit auftritt. Somit hängt die Phase des Genrhythmus von dem Hell-Dunkel-Zeitplan ab, unter dem das Tier vor der Tötung gehalten wurde. Die blaue Linie zeigt Biolumineszenzaufnahmen aus einer SE- und Kultur, die nach dem Öffnen der Kulturschale am vierten Tag – wie durch den Pfeil angegeben – austrocknete, da sie nicht ordnungsgemäß wiederversiegelt wurde.

Die rote Linie zeigt Biolumineszenz-Aufnahmen aus einer nicht gesunden SCN-Kultur. Diese Abbildung verwendet die SCN-Kultur in einem pharmakologischen Experiment. Die Abbildung zeigt eine Spur aus einer Kultur, die zum Zeitpunkt, der durch den ersten Pfeil angegeben ist, mit einem HCN-Ionenkanal-Blocker behandelt wurde.

Über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen verringerte der Ionenkanalblocker die circadiane Oszillation und stoppte sie dann beim zweiten Pfeil. Die Substanz wurde ausgewaschen und durch ein konditioniertes Kontrollmedium ersetzt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, schnell, aber sorgfältig zu arbeiten, um die Vitalität des SEN-Gewebes aufrechtzuerhalten.

Es ist außerdem wichtig, Ihren Vibram-Schnittprozess zu standardisieren, um jedes Mal die gleiche Ebene des SEN zu erhalten. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die SEN-Kultur und das SCN-Organ, typischerweise auf einer Membran, präpariert und die Expression von Clock-Genen oder Proteinen als durch Lumineszenz induzierte Luciferase in den Kulturen überwacht.