JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:46 Min. • February 26th, 2026
Beginnen Sie mit dem Supernatant, das während der In-vitro-Fermentation von Exopolysacchariden vom menschlichen Darmmikrobiom produziert wird. Der Supernatant enthält deprotonierte kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) und andere Metaboliten.
Fügen Sie Metaphosphorsäure hinzu, um den pH-Wert des Supernatanten zu senken, und Wirbel, um gründlich zu vermischen. Dies wandelt SCFAs in ihre protonierten Formen um, die für die Gaschromatographie geeignet sind.
Zentrifugieren, um Ablagerungen zu trennen und das Supernatant zu sammeln, das SCFAs und andere Metaboliten enthält.
Filtern Sie das Überstandsmittel, um Restreste zu entfernen und Störungen mit der Chromatographie zu vermeiden.
In einem Hochleistungsgaschromatographiesystem wird das Überleitungsmittel in den erhitzten Einlass injiziert, um ihn zu verdampfen. Anschließend mischt man den Dampf mit einem Inertgas und leitet ihn durch eine polare stationäre Phasensäule zur Trennung.
SCFAs interagieren mit der stationären Phase der Säule und trennen sich je nach Flüchtigkeit, wobei kürzere Säuren früher eluieren als längere.
Identifizieren Sie die Konzentrationen verschiedener SCFAs, indem Sie die Ergebnisse mit internen Standards vergleichen. Dies spiegelt den mikrobiellen Abbau von Exopolysacchariden unter darmähnlichen Bedingungen wider
Um die Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion zu untersuchen, geben Sie 1 Milliliter der fermentierten Supernatanten zu 2 Milliliter-Zentrifugenröhren und geben Sie 0,2 Milliliter von 25 Gewichts-/Volumenprozent Metaphosphorsäure zu jeder Probe. Vortex, um die Lösungen gründlich zu mischen. Zentrifugieren Sie die Gemische bei 13.000 Mal g für 20 Minuten.
In der Zwischenzeit werden Lösungen von 120 millimolaren Essigsäuren, Propionsäure, Butyrsäure, Isobutyrinsäure, Baldrsäure und Isovalersäure in Röhren vorbereitet. Geben Sie dann 1 Milliliter jeder vorbereiteten Säure in ein Rohr mit 1,2 Millilitern 25 Gewichts-/Volumen-Prozent-Metaphosphorsäure und füllen sie als Standardcocktails in die Probeflasche des Gaschromatographie-Instruments.
Nehmen Sie die Röhren aus der Zentrifuge und übertragen Sie die Supernatanten in frische Röhren. Verwenden Sie eine Spritze mit einem 0,22-Mikron-Filter, um die Supernatanten in neue Röhren für die Gaschromatographie zu filtern.