Zeitrafferbildgebung der Chromosomensegregation bei fluoreszierend markierten Bakterien

Beginnen Sie mit einem nährstoffreichen Agarose-Pad auf einem Metallrahmen, der Bakterien enthält, die fluoreszierend markierte Chromosomen-Ursprünge und fluoreszierende Mikrosphären zeigen.

Das Agarose-Pad unterstützt die bakterielle Bindung und Beweglichkeit, und fluoreszierende Mikrosphären dienen als Referenz zur Verfolgung der Chromosomensegregation.

Fügen Sie dem Objektivobjektiv in der vorgeheizten Inkubationskammer eines umgekehrten Weitfeldmikroskops Tauchöl hinzu.

Lege die Probe über die Linse und fokussiere dich dann auf einen Bereich mit mehreren Bakterien und mindestens einer fluoreszierenden Mikrosphäre.

Starten Sie Zeitrafferaufnahmen und nehmen Sie sowohl Phasenkontrast- als auch Fluoreszenzbilder auf.

Der fluoreszenzmarkierte Ursprung der Replikation erscheint als heller Haufen nahe einem Ende der Zelle.

Während der Teilung dupliziert sich der Ursprung; ein Cluster bleibt am ursprünglichen Ende, während der andere Cluster zum neu entstandenen Zellende migriert.

Dieses Setup ermöglicht die Nachverfolgung der Chromosomensegregation über mehrere Teilungen hinweg und kann angepasst werden, um ähnliche dynamische Prozesse bei anderen Bakterien, einschließlich pathogener Spezies während Wirtsinteraktionen, zu visualisieren.

Um eine Zeitraffermikroskopie durchzuführen, schalten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die Mikroskopsteuerungssoftware. Wählen Sie das richtige Objektiv sowie die richtigen Spiegel und den Filter, um Phasenkontrastbilder sowie Bilder von grün-fluoreszierend-, rot-fluoreszierenden oder gelb-fluoreszierenden Proteinen zu erhalten. Geben Sie einen Tropfen hochwertiges Immersionsöl auf die Linse des Objektivs und auf den Boden der Probe, die bei 32 Grad Celsius vorinkubiert ist.

Mit der Lochseite zum Objektiv hin platzieren Sie den Metallrahmen mit der Probe auf die Mikroskopbühne und befestigen Sie die Probe dann sicher im Stufenhalter. Konzentriere dich auf die Zellen, indem du die Bühne in Z-Richtung näher zum Ziel bewegst. Wenn das Öl auf dem Objektiv und der Probe Kontakt haben, bewegt man die Stufe in X/Y-Richtung.

Wechsle zur Metamorph-Software und öffne das Acquire-Tool. Wähle Phasenkontrast in der Einstellungs-Dropdown-Liste aus und setze die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden. Klicken Sie auf Live zeigen, Zelle in die Brennebene bringen und die Bühne in X/Y-Richtung bewegen, bis mehrere einzelne Felder im Sichtfeld sichtbar sind.

Stellen Sie sicher, dass sich mindestens eine fluoreszierende Mikrosphäre im Sichtbereich befindet, um die aufgenommenen Bilder später auszurichten. Als Nächstes öffnen Sie den Multi-Dimensional Acquisition-Wizard der Mikroskopsteuerungssoftware, um ein Zeitrafferexperiment einzurichten, das es dem Mikroskop ermöglicht, Bilder bei verschiedenen Wellenlängen und Stufenpositionen aufzuzeichnen, falls erforderlich.

Im Haupt-Tab aktivieren Sie Zeitraffer und Multiple Wellenlängen. Zusätzliche Tabs erscheinen auf der linken Seite des Fensters. Klicken Sie auf den Reiter Speichern und wählen Sie Verzeichnis, um einen leeren Ordner auf der Festplatte des Computers auszuwählen und die aufgenommenen Bilder zu speichern, und aktivieren Sie dann Basisnamen Inkrementieren, wenn Datei existiert, um sicherzustellen, dass die aufeinanderfolgenden Datensätze frühere nicht überschreiben. Gib dem Experiment einen Namen mit Datum und dem Stammnamen oder Titel des Experiments.

Klicken Sie auf den Zeitraffer-Tab, um die Zeitrafferparameter anzupassen, setzen Sie das Zeitintervall auf 20 Minuten und die Dauer auf 24 Stunden. Die Anzahl der Zeitpunkte ändert sich automatisch. Klicken Sie jetzt auf den Tab Wellenlängen.

Wählen Sie die Anzahl der Wellenlängen aus, die für jedes Bild zu jedem Zeitpunkt erfasst werden sollen, indem Sie die Anzahl ändern. Select erlaubt separate, hardwarebasiert gespeicherte AF-Position für jede Wellenlänge. Klicken Sie oben auf den Reiter Erste Wellenlänge.

In der Dropdown-Liste Beleuchtung wählen Sie Phasenkontrast. Wählen Sie 100 Millisekunden für die Belichtung und wählen Sie in der Dropdown-Liste Erwerben jeden Zeitpunkt. Deaktiviere Auto-Expose in der Dropdown-Liste, indem du "Never" wählst, und wähle in der Dropdown-Liste "Jede Erwerbung" für Auto-Fokus.

Stellen Sie die Belichtung für jede Wellenlänge, wie gerade demonstriert, mit den folgenden Parametern ein. Um dann Bilder von mehreren Bühnenpositionen zu erfassen, aktivieren Sie im Haupttab Mehrere Bühnenpositionen. Klicken Sie auf den Reiter Bühne und klicken Sie auf die Live-Taste, um das Sichtfeld zu betrachten.

Bewege die Bühne in X/Y-Richtung, bis ein ROI im Sichtfeld liegt. Speichere die X- und Y-Koordinaten im Reiter Stage, indem du auf das Pluszeichen klickst. Bewegt die Bühne erneut in X/Y-Richtung, bis ein neuer ROI gefunden wird, und speichert die Koordinaten erneut, indem ihr auf das Plus-Zeichen klickt.

Mach weiter, bis die gewünschte Anzahl der Regionen gespeichert ist. Überprüfen Sie noch einmal, ob die Zellen im Fokus sind, indem Sie auf die verschiedenen gespeicherten X- und Y-Positionen klicken, und starten Sie den Hardware-Autofokus, indem Sie AFC halten, um die gespeicherte Z-Position während des Experiments konstant zu halten. Starten Sie die Zeitrafferaufnahme im Multi-Dimensional Acquisition-Wizard der Mikroskopsteuerungssoftware, indem Sie auf Acquire klicken.

Überprüfen Sie, ob die Zellen nach den ersten Zeitpunkten der Zeitrafferaufnahmen noch scharf sind, um die Bildqualität zu maximieren, und fokussieren Sie bei Bedarf neu.