Verarbeitung infizierter Gewebe zur bakteriellen Enumeration in einem Maus-Koinfektionsmodell

Beginnen Sie mit einer Maus, die mit einem pathogenen Bakterium und einem Virus mitinfiziert ist.

Das Virus schädigt die epithelliale Auskleidung des oberen Atemwegs der Maus, was die Ausbreitung der Bakterien vom Nasopharynx in die Lunge erleichtert.

Geben Sie die entnommenen Mäuselungen in eine Schale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS.

Zerkleinere die Lunge in kleine Stücke und vermische sie gut.

Übertragen Sie die Hälfte des Lungengewebes in ein Rohr mit PBS.

Setzen Sie eine sterilisierte Gewebehomogenisiersonde in den Schlauch mit dem Lungengewebe.

Homogenisiere das Gewebe, um die Bakterien in das PBS freizusetzen.

Verdünnen Sie das Homogenat und verdünnen Sie die Verdünnungen auf einer nährstoffreichen Agarplatte.

Inkubieren Sie die Platte, damit bakterielle Kolonien entstehen können.

Zählen Sie diese Kolonien, um die Bakterienlast der Lunge zu quantifizieren, was die bakterielle Belastung in der Lunge widerspiegelt.

Für die Lungenentnahme schneiden Sie mit einer Sektionsschere die Seiten des freiliegenden Brustkorbs ab und ziehen Sie die Rippen vorsichtig zum Kopf der Maus, um das Herz freizulegen. Führen Sie eine 25-Gauge-Nadel, die an eine 10-Milliliter-Spritze angeschlossen ist, vorgefüllt mit PBS, in den rechten Ventrikel ein und beginnen Sie langsam mit dem Perfusieren. Achten Sie auf das Bleichen der Lunge als Indikator für eine erfolgreiche Perfusion.

Spülen Sie langsam, um das Lungengewebe nicht zu beschädigen. Heben Sie das Herz mit der Pinzette an und machen Sie einen Schnitt, um Lunge und Herz zu trennen. Nach der Trennung nehmen Sie alle Lungenlappen mit einer Pinzette auf und spülen Sie in einer Schale mit sterilem PBS, um eventuelle Restblute zu entfernen.

In einer Petrischale die Lunge in kleine Stücke zerkleinern und gut vermischen. Entfernen Sie die Hälfte der Lungenmischung, um die bakterielle CFU oder virale PFU zu bestimmen, und legen Sie sie in ein rundes 15-Milliliter-Rohr, vorgefüllt mit 0,5 Millilitern PBS zur Homogenisierung.

Um das gesammelte Gewebe zu homogenisieren, reinigen Sie die Homogenisiersonde, indem Sie sie in 70 % Ethanol geben und den Homogenisator mit 60 % Leistung für 30 Sekunden einschalten. Wiederholen Sie diesen Schritt 10 Sekunden lang in sterilem Wasser.

Homogenisiere jedes Gewebe für 1 Minute. Zur Aufzählung der Bakterienzahlen, Plattenserialverdünnungen auf Blutagarplatten. Um die gesamte CFU zu berechnen, verwenden Sie 10 Mikroliter zur Plattierung und notieren Sie das Endvolumen in Millilitern pro Probe. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.