Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die postsynaptische Aktivität an den afferenten Synapsen der inneren Haarzellen zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst das sensorische Epithel einer Cochlea freigelegt wird, die kürzlich einer enthaupteten Ratte entnommen wurde. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den exzidierten apikalen Stoff zu positionieren, einen modifizierten Deckglas aufzudrehen und in die Aufnahmekammer zu übertragen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, mit einer Aufzeichnungselektrode einen afferenten Stab zu lokalisieren und Zugang zu ihm zu erhalten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die afferente Fasermembran dicht zu versiegeln und dann zu brechen, wodurch die gesamte Zellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik festgelegt wird. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das postsynaptische Auftreten oder die Potentiale von einer einzelnen Bandsynapse durch die Elektrophysiologie der Ganzzell-Patch-Clamp zeigen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Dissektion und Aufbereitung von Cochlea-Gewebe schwer zu erlernen ist und die kleinen afferenten Fasern schwer zu erkennen und zugänglich sind. Bereiten Sie vor Beginn der Dissektion einen modifizierten Deckschirm vor, der die Vorbereitung während der Aufnahmen an Ort und Stelle hält. Tragen Sie mit einem acht bis 12 Millimeter großen kreisförmigen Glasdeckglas einen Tropfen halb ausgehärteten Sicherheitsglas in Richtung des Randes des Deckglases auf.

Legen Sie das dicke Ende einer feinen Insektennadel auf das Deckglas. Halten Sie die Insektennadel fest gegen das Glas. Erhitzen Sie mit einer Pinzette den Schwellerschutz gegen eine erhitzte Spule, um sich zu verfestigen.

Bereiten Sie 10 bis 20 Mikroelektroden vor, wie im Begleittext beschrieben. Nach dem Feuerpolieren mit einer Mikroschmiede sollte die Mikroelektrode einen äußeren Spitzendurchmesser von etwa einem Mikrometer haben. Die endgültige Dicke der Pipettenwand entspricht etwa einem Drittel eines Mikrometers nach der Betäubung und Enthauptung einer drei Wochen alten Ratte.

Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie die Haut entfernen, indem Sie den Kopf präparieren und das Gehirn entfernen. Um das Schläfenbein freizulegen, entfernen Sie beide Schläfenknochen. Legen Sie jedes Schläfenbein in eine saubere Präparierschale, die extrazelluläre Standardlösung enthält. Der nächste Schritt besteht darin, den Knochen zu entfernen und das Schläfenbein einzukapseln, um die Cochlea freizulegen.

Halten Sie das Schläfenbein mit einer Pinzette fest an der Basis. Identifizieren Sie das runde und ovale Fenster und die Cochlea. Richten Sie die Cochlea so aus, dass das ovale Fenster und die spiralförmige Seite der Cochlea nach oben zeigen.

Entfernen Sie überschüssigen Knochen um die Cochlea. Verwenden Sie eine zweite feine Pinzette, um den Knochen direkt von der Cochlea abzuschlagen, beginnend mit dem Bereich, der transparenter ist als der Rest des Knochens. Hier ist der Knochen dünner und lässt sich leichter entfernen.

Fahren Sie mit dem Entfernen des Knochens um die apikale Spirale fort. Verwenden Sie eine Mikros-Präparierschere, um die Modis unterhalb der apikalen Drehung zu durchtrennen. Trennen Sie dann die apikale Drehung von den unteren Drehungen der Cochlea.

Achten Sie darauf, die apikale Spule zu schützen. Es sollte nicht gezogen oder gedehnt werden. Entfernen Sie schließlich die apikale Drehung aus der Cochlea, ohne das Gewebe zu sehr zu zerreißen.

Verwende eine feine Pinzette, um den Rest des Knochens zu entfernen. Der nächste Schritt besteht darin, die STR der Oculis und der Tialmembran zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die STR der Oculis, den glänzenden Gewebestreifen, der sich außerhalb der Haarzellregion befindet.

Achten Sie darauf, die sensorischen Haarzellen nicht zu entfernen, da sie sich leicht zusammen mit der STR der Oculis ablösen können. Als nächstes lösen Sie die Tialmembran mit einer feinen Pinzette. Die glänzende, halbtransparente Membran, die über den sensorischen Haarzellen sitzt, schneidet nun überschüssiges Gewebe und Knochen ab und glättet das Präparat mit der Pinzette.

Dies ist notwendig, damit das Gewebe gleichmäßig unter einer Nadel platziert werden kann. Das Sezieren ist nun abgeschlossen. Legen Sie das Präparat unter die Nadel auf dem vorbereiteten Deckglas und achten Sie darauf, dass die Nadel nach Abschluss der Sektion von den Haarzellen entfernt positioniert ist.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Präparat in die Aufnahmekammer zu übertragen, während Sie einen Tropfen extrazelluläre Flüssigkeit auf dem Deckglas halten, der das Cochlea-Gewebe hält, und beginnen Sie sofort mit der extrazellulären Lösung. Um ein besseres Überleben des Präparats zu gewährleisten, verwenden Sie das 10-fach-Objektiv des Mikroskops oder das 40-fache Wasserimmersions-DIC-Objektiv. Um das Präparat zu lokalisieren, richten Sie das Präparat so aus, dass die Aufzeichnungselektroden sich den inneren Haarzellen im rechten Winkel zu ihren Seitenwänden nähern können.

Wenn die Sichtbarkeit des basalen Bereichs der inneren Haarzellen eingeschränkt ist, weil das Präparat eingerollt ist, drücken Sie mit einer Aufzeichnungselektrode den äußeren Rand des Präparats gegen den Glasabdeckglas. Achten Sie darauf, dass die inneren Haarzellen nicht gedrückt werden. Bei dieser Präparation hält die obere Elektrode den äußeren Rand der Präparation nach unten an den unteren Elektrodenmarkierungen, an denen sich die afferenten Stäbe befinden.

Als Referenz zeigt die NC 70 Nuv Con Kamera das vergrößerte Forex-Bild auf dem Monitor an, um zu beurteilen, ob das Gewebe im inneren Bereich der Haarzellen gesund ist. Finden Sie die Haarbündel als Bezugspunkt und fokussieren Sie sich nach unten, um die Zellkerne zu finden. Fokussieren Sie weiter nach unten zur Basis der inneren Haarzellen mit ihren afferenten Enden und wieder nach oben, bis Sie die Höhe der Kerne auf dem Monitor erreichen.

Lokalisieren Sie nun die afferenten Stäbe um die Basis der inneren Haarzellen. Schlagstöcke sind kugelförmig oder ellipsoid, haben einen Durchmesser von etwa einem Mikrometer und sind hell und glänzend. Du wirst sie finden, indem du dich nach oben und unten konzentrierst.

Der nächste Schritt besteht darin, einen Weg zu den afferenten Fasern freizumachen, indem eine Aufzeichnungselektrode mit einer Ein-Mikrometer-Spitze verwendet wird, die mit intrazellulärer Lösung gefüllt ist. Üben Sie Überdruck aus und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Elektrode zum Präparat zu manövrieren. Verwenden Sie diese Elektrode, um einen Schnitt in der Vorbereitung auf Höhe der inneren Haarzellbasis zu machen.

Schieben Sie die Elektrode mit Überdruck zwischen die dünne Schicht der Stützzellen und die inneren Haarzellen, um einen Zugangsweg zu dem Bereich an der Basis der inneren Haarzellen zu schaffen. Entfernen Sie vorsichtig die Elektrode und ersetzen Sie sie durch eine frische Elektrode mit einer Spitze mit einem Durchmesser von einem Mikrometer, die mit intrazellulärer Lösung gefüllt ist. Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode unter Verwendung von Überdruck, um eine saubere Elektrodenspitze zu erhalten, durch das Zugangsloch um benachbarte Stützzellen in Richtung des afferenten Stabs.

Stellen Sie sicher, dass sich die Elektrodenspitze direkt vor den afferenten Stabstäben befindet, um der Bewegung der Pipette mehr Widerstand zu bieten als die Stützzellen und die innere Haarzellmembran. Dieser Unterschied ist zu spüren, wenn die Pipette bewegt wird, die Pipette auf und ab bewegt und gedrückt wird, um sicherzustellen, dass sich die Bhuton bewegt. Dies deutet darauf hin, dass sich die Pipettenspitze und das Bhuton in derselben Fokusebene befinden, wobei die Elektrode gegen das afferente Bhuton gedrückt wird. Gleichzeitig wird der Überdruck abgelassen und der Sog ausgeübt, um eine Giga-Ohm-Dichtung zu bilden.

Wenden Sie sanfte Saugstöße an, um die Membran in der Elektrode aufzubrechen, um eine Aufzeichnung der gesamten Zelle zu erhalten. Wenn es sich bei der gepflasterten Zelle um einen afferenten Stab handelt, werden im Aufzeichnungsmodus der gesamten Zelle kleine kapazitive Transienten beobachtet. Diese Abbildung zeigt typische transiente Aufzeichnungen, die von einer afferenten Faser aufgezeichnet wurden.

Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der synaptischen Aktivität. Wenn die afferente Faser keine spontane Aktivität zeigt, depolarisieren Sie die Haarzelle, indem Sie eine extrazelluläre Lösung mit einer höheren Kaliumkonzentration auftragen. Diese Abbildung zeigt typische Stromspannungsverhältnisse für AFF-Fasern auf der linken Seite und innere Haarzellen auf der rechten Seite.

Die Stromspannungsverhältnisse wurden mit einem Haltepotential von minus 84 Millivolt mit Spannungsschritten von minus 124 Millivolt bis plus 36 Millivolt in 10-Millivolt-Schritten erfasst. Die Spannungen sind rechts von einigen Leiterbahnen dargestellt, die sich auf die Stromspannungsverhältnisse einer afferenten Faser konzentrieren. Beachten Sie, dass das exzitatorische postsynaptische Auftreten oder EPCs während der meisten Spannungsschritte vorhanden sind.

Die EPCs kehrten sich bei etwa positiven sechs Millivolt ins Positive um. Diese Aufzeichnung wurde in Gegenwart von Tetra bis Toxin durchgeführt, um spannungsgesteuerte Natriumströme zu blockieren, ohne dass der Blocker Schnell aktivierende Natrium-Einströmströme zusätzlich in der Aufzeichnung aufgetreten wäre und die Aufzeichnung als afferente Faseraufzeichnung identifiziert hätte. Beachten Sie den langsam aktivierenden Einströmstrom bei hyperpolarisierenden Spannungen.

Dieser Strom ist in den inneren Haarzellen oder Stützzellen nicht vorhanden und liefert einen guten Hinweis darauf, dass die Aufzeichnung von einer afferenten Faser stammt. Diese Aufzeichnungen zeigen die Stromspannungsverhältnisse für eine innere Haarzelle. Der Pfeil zeigt auf die schnell aktivierenden nach außen gerichteten Kaliumströme bei positiven Potentialen.

Es folgen verzögerte Gleichrichter-Kaliumströme aufgrund eines schmalen Pipettendurchmessers und eines hohen Zugangswiderstands. Die hier gezeigten inneren Haarzellströme sind kleiner als erwartet, um genaue Aufzeichnungen der inneren Haarzellströme zu erhalten. Es sollten Pipetten mit geringeren Zugangswiderständen verwendet werden.

Die hier vorgestellten Aufnahmen zeigen jedoch, dass die Stromspannungsverhältnisse von inneren Haarzellen und afferenten Fasern deutlich unterschieden werden können. Diese Abbildung zeigt synaptische Ströme, die von einer afferenten Faser aufgezeichnet wurden. Beachten Sie die variable Größe und Form der EPCs.

Die Aufzeichnungen wurden bei Raumtemperatur mit Tetratoin durchgeführt, um die spannungsgesteuerten Natriumströme zu blockieren. Diese Abbildung zeigt gleichzeitige Aufnahmen von einer inneren Haarzelle und einem kontaktierenden afferenten Stab. Ein Spannungsschritt wurde verwendet, um die innere Haarzelle zu depolarisieren, und als Reaktion darauf wurden nach innen gerichtete Kalziumströme aus der inneren Haarzelle aufgezeichnet, der Kalziumeinstrom führte zur Freisetzung von Neurotransmittern und aktivierte EPCs im afferenten Stab.

Beachten Sie, dass die synaptische Depression, die während einer 50 Millisekunden Depolarisation der inneren Haarzellen auftritt, während Sie dieses Verfahren versuchen. Es ist wichtig, daran zu denken, beim Präparieren und Vorbereiten des Cochlea-Gewebes vorsichtig vorzugehen und geduldig und optimistisch zu bleiben, wenn man versucht, von afferenten Enden aus aufzunehmen.