Entstehung von Spheroplasten aus gramnegativen Bakterien
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 4:02 Min. • February 26th, 2026
Nehmen Sie ein Medien, das ein Antibiotikum zur Zellteilung blockiert.
Inokulieren Sie es mit stabförmigen, gramnegativen Bakterien.
Inkubieren Sie mit Zittern.
In Gegenwart des Antibiotikums wachsen die Bakterien weiter, ohne sich zu teilen, und bilden lange Filamente.
Sammeln Sie die Kultur und zentrifugieren Sie sie bei niedriger Temperatur. Entsorge das Überdachte und wasche die Filamente mit einer Saccharoselösung, um Lyse zu verhindern.
Verwerfen Sie die Saccharoselösung.
Füge einen Puffer hinzu, gefolgt von Enzymen und EDTA. EDTA schwächt die äußere Membran, sodass Lysozym in die Peptidoglykan-Schicht eindringen und sie abbauen kann.
Dies entfernt die Zellwand, sodass die bakterielle Zelle schrumpfen kann. DNase I bricht die freigesetzte chromosomale DNA aus den Zellen ab und verhindert das Klumpen von Zellen.
Fügen Sie eine hypotonische Lösung mit sanftem Wirbel hinzu, sodass die Zelle Wasser aufnehmen kann.
Die flexiblen Membranen ermöglichen es der Zelle, eine kugelförmige Form anzunehmen, die als Spheroplast bezeichnet wird.
Übertragen Sie einen Aliquot mit den Spheroplasten in zwei Röhren mit einer gekühlten isotonen Lösung, um die Spheroplasten zu stabilisieren.
Um gramnegative E.coli-Spheroplasten herzustellen, verdünnen Sie die Übernachtkultur mit einem Verhältnis von 1 bis 100 in 25 Millilitern TSB in einer 250-Milliliter-Flasche und bringen Sie die Bakterien für weitere 2,5 Stunden zurück in den schüttelnden Inkubator. Wenn die Lösung eine optische Dichte von 0,5 bis 0,8 bei 600 Nanometern erreicht hat, verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis eins zu zehn in frischem TSB in einer neuen 250-Milliliter-Flasche für eine zweite 2,5-stündige Inkubation mit einer endgültigen effektiven Konzentration von 60 Mikrogramm pro Milliliter Cephalexin.
Einzellige Filamente von etwa 50 bis 150 Mikrometern Länge herzustellen, wie sie unter einem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung visualisiert werden. Zentrifugiere die bakterielle Lösung, um die Filamente zu entnehmen, und dekantiere das Supernatant. Waschen Sie die Filamente mit vorsichtiger Zugabe von einem Milliliter 0,8 molaren Saccharose und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
Nach einer Minute entsorgt man den Supernatanten, ohne das Pellet zu stören, und fügt die angegebenen Reagenzien in der jeweiligen Reihenfolge zu den Filamenten hinzu. Nach zehn Minuten bei Zimmertemperatur werden nach und nach ein Milliliter Lösung A über einen Zeitraum von einer Minute hinzugefügt und die Lösung vorsichtig von Hand gewirbelt. Inkubieren Sie die Lösung vier Minuten lang bei Raumtemperatur und teilen Sie die Filamentsuspension dann in zwei gleich große Aliquoten zwischen zwei 15-Milliliter-Kegelröhren mit sieben Millilitern vier Grad Celsius Lösung B. Anschließend werden die Filamente durch Zentrifugation gepelletiert und mit einer serologischen Pipette vorsichtig alle bis auf ein bis zwei Milliliter des Supernatanten entfernt werden, ohne die Pellets zu stören.
Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um die Pellets vorsichtig wieder aufzuhängen. Überprüfen Sie ein kleines Aliquot der Probe auf Spheroplastbildung mittels Lichtmikroskopie. Der Spheroplast kann dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden oder bis sie drei Gefriertauzyklen durchlaufen haben.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Herstellung von Sphäroplasten aus gramnegativen Bakterien, insbesondere E. coli, unter Verwendung eines die Zellteilung hemmenden Antibiotikums beschrieben. Der Prozess umfasst mehrere Schritte, darunter Inkubation, Zentrifugation und die Verwendung spezifischer Reagenzien zur Schwächung der bakteriellen Zellwand.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Zellbiologie
- Biotechnologie
Hintergrund
- Sphäroplaste sind Zellen mit teilweise entfernter Zellwand.
- Sie sind nützlich zur Untersuchung zellulärer Prozesse und für biotechnologische Anwendungen.
- Gramnegative Bakterien besitzen komplexe Zellwände, die spezifische Methoden für die Sphäroplasterstellung erfordern.
- Der Einsatz von Antibiotika kann dabei helfen, verlängerte bakterielle Formen zu erzeugen, die leichter zu handhaben sind.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Herstellung von Sphäroplasten aus E. coli.
- Vermittlung der Untersuchung bakterieller Zellprozesse ohne Störung durch die Zellwand.
- Optimierung der Bedingungen für Stabilität und Lebensfähigkeit von Sphäroplasten.
Verwendete Methoden
- Inokulation von Medien mit stäbchenförmigen, gramnegativen Bakterien.
- Inkubation mit einem die Zellteilung hemmenden Antibiotikum zur Förderung der Filamentbildung.
- Zentrifugation und Waschen mit Saccharose zur Verhinderung von Lyse.
- Verwendung von EDTA und Lysozym zur Schwächung und Auflösung der Zellwand.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Bildung von Sphäroplasten aus E. coli wurde erreicht.
- Bakterienfilamente wurden unter dem Mikroskop sichtbar gemacht.
- Bedingungen für die Stabilität von Sphäroplasten wurden etabliert.
- Sphäroplaste können für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden, ohne dass eine signifikante Abnahme der Vitalität auftritt.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen geeigneten Ansatz, um gramnegative Bakterien zu untersuchen.
- Das Verständnis der Sphäroplastenbildung kann bei verschiedenen mikrobiologischen Anwendungen hilfreich sein.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um andere bakterielle Spezies zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erzeugung von Sphäroplasten aus gramnegativen Bakterien ermöglicht eine präzise Untersuchung membranassoziiierter Prozesse und die Lokalisation von Wirkstoffen, was für die frühe Entdeckung antimikrobieller Substanzen entscheidend ist. Diese Methode unterstützt die mechanistische Entlastung von Risiken und die Validierung von Wirkorten, indem sie ein kontrolliertes System bereitstellt, um Wechselwirkungen von Verbindungen zu bewerten, ohne die störenden Einflüsse der bakteriellen Zellwand. Das Verfahren erhöht die Vorhersagesicherheit in Screening- und translationsorientierten Arbeitsabläufen für Antiinfektiva-Forschungs- und Entwicklungsportfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Beurteilung der Lokalisation antimikrobieller Peptide und ihrer Wechselwirkungen mit der Membran.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von bakteriellen Hülle-Zielen durch Entfernung der Zellwandbarriere.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem Membranwirkungen von Beiträgen der Zellwand isoliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes System zur Bewertung der Permeabilität und Aktivität von Verbindungen auf Membranebene.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und quantitative Beurteilung der Wirkung von Verbindungen auf Sphäroplaste.
- Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Substrate für nachgeschaltete Hochdurchsatz- oder mechanistische Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung der Lokalisation von Wirkstoffen und ist somit kompatibel mit translationalen Biomarker-Strategien.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von membranzielgerichteten Wirkstoffen.
- Verringert die biologische Uneindeutigkeit bei der Auswahl präklinischer Modelle für Antiinfektiva-Programme.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur Sphäroplasterzeugung fügt sich in den Bereich der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen ein und schafft eine Brücke zwischen der Zielvalidierung und dem Screening auf membranaktive Verbindungen.
- Entdeckungsbiologie Unterstützt die Hypothesenprüfung zu membranassoziierten Mechanismen durch Isolierung der inneren Membran.
- Screening: Liefert reproduzierbare, zellwandfreie Systeme zur quantitativen Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Ermöglicht die direkte Messung der Lokalisation von Verbindungen und der Membranpermeabilisierung mittels Mikroskopie und quantitativer Assays.
- Translationale Forschung Ermöglicht die Abstimmung von in-vitro-Ergebnissen mit in-vivo-Membran-Targeting-Strategien.
- Unternehmensweites Wiederverwenden: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für vielfältige Forschungsinitiativen im Bereich Antiinfektiva und Membranbiologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Bewertung membrangetargeteter Verbindungen und der Validierung von Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Sphäroplastpräparation für reproduzierbare und skalierbare Arbeitsabläufe.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Klärung des Wirkmechanismus von Verbindungen auf Membran-Ebene.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung membranaktiver Wirkstoffkandidaten und verringert biologische Unsicherheiten in späteren Entwicklungsstadien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der bakteriellen Zellbiologie und aseptischer Technik.
- Benötigt Zugang zu Zentrifugations-, Mikroskopie- und Kühlungseinrichtungen.
- Erfordert eine standardisierte Vorbereitung und Handhabung von Sphäroplasten über Teamgrenzen hinweg.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene gramnegative Arten oder Wirkstoffklassen notwendig.
- Die Stabilität und Vitalität von Sphäroplasten ist durch Einfrier- und Auftauzyklen sowie die Lagerdauer begrenzt.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026