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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 3:47 Min. • February 26th, 2026
Beginnen Sie mit zwei Glasboden-Mikroschalen, die Suspensionen eines biofilmbildenden Bakteriums enthalten.
Die Behandlungsschale enthält ein aktives, signalstörendes Enzym, während die Kontrolle das inaktivierte Enzym umfasst.
Decken Sie die Schüssel ab und inkubieren Sie, damit bakterielle Haftung an der Mikroschüsseloberfläche entsteht.
Waschen, um nicht haftende Zellen zu entfernen, dann frisches Medium mit den Enzymen einführen und inkubieren.
In der Kontrollschale kommunizieren die Bakterien über Signalmoleküle und produzieren extrazelluläre polymere Substanzen (EPS), wodurch ein Biofilm entsteht.
Das aktive Enzym baut die Signalmoleküle ab, stört ihre Funktion und reduziert die Bildung von Biofilmen.
Erneuern Sie sich mit frischem Medium und inkubieren Sie weiter, um die biofilmstörenden Effekte des Enzyms zu verstärken.
Entfernen Sie das Medium, fügen Sie fluoreszierend markierte Lektine hinzu und inkubieren Sie, damit Lektin an das EPS bindet.
Waschen Sie, um ungebundenes Lektin zu entfernen.
Inkubieren Sie mit einem Fixativ, um die Biofilm-Architektur zu erhalten, und spülen Sie dann die Schale.
Aufnahme von konfokalen mikroskopischen Bildern, um die enzymvermittelte Unterdrückung der Biofilmbildung zu bewerten.
Um eine konfokale Laserscanning-Mikroskopie, oder CLSM, von A. baumannii S1-Biofilmen durchzuführen, wird eine 5-Milliliter-Kultur von A. baumannii S1 in LB bei 30 Grad Celsius 16 Stunden lang in einem Schüttelinkubator gezüchtet. Passt die Kultur von A. baumannii S1 auf einen OD600 von 0,8 an.
Dann verwenden Sie frisches LB mit 1,2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes GKL-Enzym, um die Kultur von 1 bis 100 zu verdünnen, und geben Sie 1 Milliliter in eine 35-Milliliter-Glasboden-Mikroschale. Decken Sie die Mikroschüssel mit einem Deckel ab, geben Sie sie in einen 10-Liter-Kunststoffbehälter und verschließen Sie ihn, bevor Sie die Schale drei Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nachdem Sie das Medium vorsichtig entfernt haben, geben Sie 1 Milliliter frisches Medium mit 30 Mikrolitern gereinigtem GKL-Enzym hinzu und inkubieren Sie dann weitere 21 Stunden bei 30 Grad Celsius.
Entferne das Medium vorsichtig ein zweites Mal und ersetze es durch ein weiteres 1 Milliliter GKL-Enzym in frischem Medium. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Medium vorsichtig entfernt und 500 Mikroliter à 5 Mikrogramm pro Milliliter Alexa Fluor 488 konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin gelöst in HBSS hinzugefügt.
Inkubieren Sie die Mikroschüssel bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, um die Biofilme zu färben. Um die Biofilme zu fixieren, fügen Sie 500 Mikroliter 3,7 % Formaldehyd in HBSS gelöst hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie 2 Milliliter HBSS, um die Mikroschüssel einmal zu waschen, und entfernen Sie dann die Lösung vollständig.
Lagere die Schüssel vor der CLSM-Bildgebung im Dunkeln bei 4 Grad Celsius. Für die CLSM-Bildgebung und -Analyse verwenden Sie ein 63-faches Objektiv, um 97 Stacks pro Bild mit einem Intervall von 0,21 Mikron pro Stack zu erzeugen.