Isolierung intrazellulärer pathogener Bakterien aus infizierten Wirtszellen

Nehmen Sie eine Suspension von pathogenen Bakterien.

Fügen Sie die Suspension einer angehefteten Kultur von Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen oder BMDM-Zellen hinzu und inkubieren Sie.

Die Bakterien nutzen ihre Oberflächenproteine, um an Wirtszellrezeptoren zu binden und so die Haftung zu fördern.

Spüle mit einem Puffer, um nicht haftende Bakterien zu entfernen.

Fügen Sie frisches Medium hinzu und inkubieren Sie.

Die anhaftenden Bakterien werden dann von der Wirtszelle internalisiert.

Fügen Sie ein Antibiotikum hinzu, um nicht internalisierte Bakterien abzutöten.

Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie mit Puffer.

Fügen Sie gekühltes Wasser hinzu, um die Wirtszelle zu lysieren, wodurch Zellinhalt, der Zellkern und die internalisierten Bakterien freigesetzt werden.

Sammeln Sie das Zelllysat und zentrifugieren Sie, um zelluläre Ablagerungen auszufällen.

Sammle das Supernatant, das die Bakterien enthält. Führen Sie es durch ein Filtergerät, um intakte Bakterien einzufangen.

Falten Sie das Filterpapier und legen Sie es in ein Rohr.

Schnellgefrieren in flüssigem Stickstoff, um die zelluläre Integrität zu erhalten.

Lagern Sie unter kalten Bedingungen für den weiteren Gebrauch.

Mit 0,5 Millilitern der gewaschenen bakteriellen Suspension infizieren Sie jede Makrophagenplatte. Wenn Sie mehrere Platten verwenden, sollten die Infektionen 15 Minuten auseinandergesetzt werden, damit jede Platte am Ende der Infektion einzeln entnommen werden kann. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius verwenden Sie PBS, um die infizierten Zellen zweimal zu waschen, um lose Bakterien zu entfernen, und anschließend 30 Milliliter vorgewärmtes BMDM-Medium hinzuzufügen.

Inkubiere 30 Minuten, damit Bakterien sich verinnerlichen können. Eine Stunde nach der Infektion wird Gentamicin zu einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzugefügt, um verbleibende extrazelluläre Bakterien abzutöten. Bauen Sie das Filtergerät zusammen, indem Sie einen Filterkopf auf eine Sammelflüssigkeitsflasche mit einem Vakuumauslassanschluss setzen.

Dann setzen Sie einen 0,45-Mikron-Filter auf den Filterkopf, gefolgt von einem Zylindertrichter, und verwenden Sie eine Metallklemme, um die verschiedenen Teile zu sichern. Sechs Stunden nach der Infektion sollten Sie die Zellmonoschicht vor der Entnahme unter dem Mikroskop untersuchen. Arbeiten Sie mit einer Platte nach dem anderen, um die Bakterien zu entnehmen, verwenden Sie PBS, um die infizierten Zellen zu reinigen.

Um die Makrophagenzellen zu lysieren, geben Sie dann 20 Milliliter eiskaltes, RNAse-freies Wasser hinzu und verwenden Sie schnell, aber vorsichtig einen Zellschaber zum Abkratzen der Zellen. Nach dem Sammeln der Zellen in einem 50-Milliliter-konischen Rohr für 30 Sekunden, dann mit 800-facher g und 4 Grad Celsius für 3 Minuten Zentrifugieren, um die Zellkerne der Makrophagen zu entfernen. Um Bakterien zu sammeln, lassen Sie das Überstandsmittel über das Vakuumsystem durch den Filter laufen.

Dann rollt man den Filter mit einer Pinzette und überträgt ihn schnell in ein 15-Milliliter-Kegelrohr. Verwenden Sie sofort flüssigen Stickstoff, um das Rohr einzufrieren.