JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:06 Min. • March 31st, 2026
Beginnen Sie mit einer immobilisierten, dissektionierten Mausblase, die mit β-galaktosidase-exprimierendem uropathogenem E. coli vorinfiziert ist und in eine silikonbeschichtete Mehrwellenplatte gelegt wird.
Das Lumen der Blase zeigt nach oben und legt die Epithelzellen frei, die intrazelluläre Bakteriengemeinschaften, sogenannte IBCs, enthalten.
Waschen Sie die Blase mit einem Puffer, um Rückstände und unbefestigte Bakterien zu entfernen.
Als Nächstes fügen Sie ein Fixationsmittel hinzu und inkubieren Sie, um zelluläre und bakterielle Strukturen zu erhalten.
Entferne das Fixativ und wasche mit einem Puffer.
Waschen Sie anschließend mit einem waschmittelhaltigen Puffer, um die zellulären und bakteriellen Membranen zu permeabilisieren.
Entfernen Sie den Puffer, geben Sie dann eine Lösung von X-gal, einem Substrat aus β-Galactosidase, mit Redoxreagenzien ergänzt, und inkubieren.
X-Gal- und Redoxreagenzien gelangen in die Bakterien. β-Galactosidase spaltet X-gal und bildet ein farblos Zwischenprodukt, das durch Redoxreagenzien oxidiert wird, um einen blauen Niederschlag zu bilden.
Unter einem Seziermikroskop bestätigen die blauen Punkte in der Blase die IBCs und deuten auf eine Harnwegsinfektion hin.
Für die IBC-Zählung wird die Blase nach der Entnahme in einen silikonbeschichteten Brunnen einer 6-Well-Platte mit PBS gelegt und mit einer Schere in zwei Hälften geschnitten.
Mit kleinen Metallstiften, die an den äußersten Kanten platziert sind, spreizen Sie die Blase vorsichtig, sodass das Lumen nach oben zeigt und die maximale Menge Urothels freiliegt. Nach der Durchführung der LacZ-Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben, beobachten Sie IBCs, die unter einem Dissektionsmikroskop als blaue Puncta erscheinen.