Agrobakterienvermittelte Abgabe rekombinanter viraler Klone in Maissetzlinge zur Gen-Silencing

Beginnen Sie mit Maissetzlingen, die unter kontrollierten Bedingungen wachsen, um als Wirt zu dienen.

Als Nächstes nehmen Sie Agrobacterium tumefaciens, ein pflanzenpathogenes Bakterium.

Die manipulierten Bakterien tragen ein T-DNA-Konstrukt, das ein rekombinantes virales Genom codiert. Dieses Genom enthält ein eingefügtes Genfragment, das dazu dient, ein Ziel-Mais-Gen zum Schweigen zu bringen.

Injizieren Sie die Bakterien direkt über dem Coleoptilarknoten, dem untersten Knoten der Pflanze, bis die Suspension das Coleoptil füllt und so die Lieferung ins innere Gewebe gewährleistet.

An der Injektionsstelle übertragen die Bakterien die T-DNA, die das virale Genom transportiert, in Maiszellen, wo sie in virale RNA transkribiert wird, die in das Zytoplasma übergeht.

Die RNA repliziert und löst die Produktion viraler Proteine aus, wodurch neue virale Partikel entstehen, die sich systemisch ausbreiten und eine Infektion etablieren.

Die virale RNA, die das gewünschte Genfragment transportiert, aktiviert die RNA-Interferenzmaschinerie der Pflanze, baut spezifische Mais-mRNAs ab und verstummt das Zielgen.

Dies führt zu sichtbaren Veränderungen der Phänotypen, die vom Zielgen reguliert werden, während die infizierten Pflanzen wachsen, wie etwa die Bildung einer nekrotischen Läsion, was eine erfolgreiche Gen-Silencing bestätigt.

Verwenden Sie 4 bis 7 Tage alte Maissetzlinge zur Injektion von Agrobacterium. Setze Spritze und Nadel zusammen. Injizieren Sie die bakterielle Suspension vorsichtig 2–3 Millimeter oberhalb des Coleoptilulärknotens, bis sie das Coleoptil füllt oder im Wirbel sichtbar ist, je nach Wachstumsstadium der Pflanzen.

Injiziere alle Setzlinge und wechsle die Spritze und Nadeln für die Injektion jedes Konstrukts. Phänotypische Infektion wird durch Beobachtung von Läsionen durch das Stummschalten der Kontrollgene, Läsion Mimic 22 oder Phytoen-Dessättigung auf den Blättern beobachtet.