Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung mikrobieller Interaktionen in Kokultur

Beginnen Sie mit Bioassay-Platten, eine vorbesiedelt auf der linken Seite des Nährstoffagar mit Corynebacterium propinquum und die andere ausschließlich mit Nähragar.

Nehmen Sie anschließend eine Mehrschichtplatte mit pathogener Staphylococcus-Suspension .

Senken Sie einen Impfstempel in die Brunnen, wobei die Spitzen in die Staphylococcus-Kultur eintauchen.

Wirbeln Sie den Stempel, heben Sie ihn dann an und überprüfen Sie, dass jede Spitze einen einheitlichen Tropfen enthält, um eine gleichmäßige Impfung zu gewährleisten.

Richten Sie den Stempel auf der rechten Seite der Bioassay-Platte aus und vermeiden Sie den Kontakt mit den bestehenden Kolonien.

Entfernen Sie den Stempel und hinterlassen Staphylococcus inoculum-Flecken auf dem Agar.

Wiederhole das Stampfen auf der Agarplatte allein, um eine Monokultur zu erzeugen. Brüte die Platten kopfüber aus.

In der Kokultur sezerniert C. propinquum Siderophore, kleine Moleküle, die Eisen aus dem Agar entfernen und so das Wachstum von Staphylococcus hemmen.

Nach der Inkubation vergleichen Sie das Wachstum von Staphylococcus in der Kokultur und in der Monokultur.

Eine signifikante Hemmung in der Kokultur deutet auf eine Interaktion zwischen den beiden Arten hin.

Nach der sechstägigen Inkubation der Bioassay-Platte bereiten Sie Übernachtkulturen des Zielorganismus wie zuvor beschrieben vor. Bereiten Sie die Zielplatte vor, indem Sie jede Mulde einer leeren 12-Bohrloch-Platte mit 1,8 Millilitern BHI und 200 Mikrolitern der Ziel-Übernachtkultur füllen. Setzen Sie einen sterilen Impfstempel auf die Zielplatte.

Schwenken Sie die Kulturen vorsichtig um die Brunnen, damit sie benachbarte Brunnen nicht kreuzkontaminieren. Heben Sie den Impfstempel ab und stellen Sie sicher, dass auf jeder Stempelspitze ein Tropfen verdünnter Zielkultur vorhanden ist. Platzieren Sie den Impfstempel auf eine unimpfbare Bioassay-Platte und schaukeln Sie den Stempel vorsichtig, sodass der Kulturtropfen jeden Brunnen impft.

Sobald der Stempel entfernt ist, sollte ein Kulturtropfen in den Brunnen sichtbar sein. Wenn keine Brunnen mit dem Impfstempel impft sind, werden 3 Mikroliter verdünnte Übernachtkultur mit einer Pipette auf die Brunnen gesteckt. Anschließend inokulieren Sie die Bioassay-Platten wie zuvor beschrieben, richten Sie jedoch die Stempelspitzen auf der rechten Seite der 12-Well-Platte aus, um sicherzustellen, dass der Stempel keinen Kontakt zur bestehenden Bakterienkolonie hat. Entfernen Sie den Stempel vorsichtig und legen Sie ihn zurück in die Zielplatte.

Wenn der Agar in den Brunnen ungleichmäßig verfestigt ist, wiege den Stempel sanft hin und her, aber sei vorsichtig, den Stempel nicht in das Wachstum des Testorganismus zu verschieben.

Wiederholen Sie die Impfung für jede Bioassay-Platte, bis alle Platten geimpft sind, und inkubieren Sie die Platten dann kopfüber bei der entsprechenden Temperatur sieben Tage lang.

Nach einer einwöchigen Kokultivierung des Test- und Zielorganismus bewerten Sie die Interaktionen anhand der visuellen Bewertung. Bewerten Sie die Bohrlöcher mit dem Zielorganismuswachstum, das kein Wachstum von der Monokultur zeigt, als null. Bewerten Sie die Brunnen mit vermindertem Wachstum als eins und kein Wachstum als zwei.