Stressgranulatbildung während der Shigella-Infektion von krebsartigen Epithelzellen

Beginnen Sie mit einer Mehrschichtplatte, die adhärente krebsartige Epithelzellen auf einem Deckzettel enthält.

Fügen Sie Shigella flexneri hinzu, ein pathogenes Bakterium.

Zentrifugiere die Platte, um bakteriellen Kontakt mit den Zellen zu fördern, und inkubiere dann.

Mit einem spezialisierten Sekretionssystem injiziert Shigella Virulenzproteine in die Epithelzellen.

Diese Virulenzproteine modulieren das epitheliale Signalsystem und erleichtern so die Aufnahme von Bakterien.

In den Zellen produzieren die Bakterien weiterhin Virulenzproteine, die die zelluläre Translation stören und unübersetzte mRNAs ansammeln.

RNA-bindende und signalisierende Proteine aggregieren sich mit den nicht übersetzten mRNAs und bilden membranlose zytoplasmatische Granule, die als Stressgranula bekannt sind.

Entsorge das Medium und wasche, um lose Bakterien zu entfernen.

Als Nächstes werden vorgewärmte Kulturmedien mit Gentamicin ergänzt, um oberflächengebundene Bakterien zu beseitigen.

Fügen Sie ein Fixativ hinzu, um Zellstrukturen und Stressgranulate zu erhalten.

Entsorgen Sie das Fixativ und waschen Sie es mit sanftem Schütteln, um die Reste des Fixativs zu entfernen.

Die Zellen sind bereit für eine Immunfluoreszenzfärbung, um Shigella-induzierte Stressgranulen sichtbar zu machen.

Ersetze die Spülung durch 500 Mikroliter Infektionsmedium pro Brunnen und zentrifugiere die 24-Well-Platte, um die Bakterien auf die Zellen zu schleudern.

Übertragen Sie die abgesetzten bakteriellen Kokulturen für 30 Minuten in einen 37-Grad-Gewebekultur-Inkubator, um die Infektion der Wirtszelle zu erleichtern.

Am Ende der Inkubation werden die exogenen Bakterien mit drei Spülungen in 1 Milliliter frischem 37 Grad Celsius HeLa-Kulturmedium pro Wasch entfernt.

Anschließend werden die infizierten Zellen mit 1 Milliliter frischem Kulturmedium mit Gentamicin abgedeckt und die Platte in den Zellkulturinkubator zurückgegeben.

Nach einer Stunde wird das Supernatant vollständig abgesaugt und die Proben in 0,5 Millilitern Raumtemperatur-4%-Paraformaldehyd in PBS für 30 Minuten fixiert.

Als Nächstes werfen Sie das Fixativ in den entsprechenden Abfallbehälter und waschen Sie die Überdeckungen mit 1 Milliliter Tris-Puffer-Kochsalzlösung zwei Minuten lang unter sanftem Schütteln.