Immunfärbung bakteriengefüllter Mikroläsionen in einem kardialen Mausschnitt zur Bildgebung

Beginnen Sie mit einer Folie, die einen chemisch fixierten Herzgewebeschnitt einer Maus enthält, die mit Streptococcus pneumoniae, einem pathogenen Bakterium, infiziert ist.

Diese Infektion führt dazu, dass sich extrazelluläre, bakteriengefüllte Mikroläsionen in den Herzmuskeln bilden.

Wasche den Abschnitt mit einem Puffer, um eventuelle Fixativreste zu entfernen.

Tragen Sie ein nicht-ionisches Reinigungsmittel auf, um die zellulära Membranen des Wirts zu permeabilisieren.

Waschen Sie erneut, um eventuelle verbleibende Waschmittel zu entfernen.

Inkubieren Sie den Abschnitt mit einem Blockiermittel, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.

Spülen Sie, um das ungebundene Blockmittel zu entfernen.

Führen Sie einen primären Antikörper ein, der an das kapsulare Polysaccharid der Bakterien bindet.

Waschen Sie, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und geben Sie dann einen grünen, fluorophor-markierten Sekundärantikörper hinzu, der an den primären Antikörper bindet.

Gegenfärbe mit einem Kernfarbstoff zur Markierung der Wirtszellzellkerne.

Waschen Sie den Abschnitt und montieren Sie ihn mit einem Montagemedium.

Beobachten Sie den Abschnitt mit Konfokalmikroskopie, um markierte Bakterien innerhalb der Mikroläsionen sichtbar zu machen.

Mit einem 5-Mikron-Herzschnitt auf positiv geladenen Glasobjektträgern werden die Schnitte zunächst eingefroren, dann aufgetaut und an der Luft trocknet. Fixiere die Objektträger für 10 Minuten in 10 % neutralem Formalin bei 25 Grad Celsius. Dann entfernen Sie das Fixationsmittel mit drei Waschgängen und PBS für fünf Minuten pro Wasch.

Anschließend permeabilisieren Sie das Gewebe mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten. Entfernen Sie das Waschmittel mit drei weiteren Waschen in purem PBS. Dann blockieren Sie das Gewebe mit 10%-Ziegenserum in PBS für eine Stunde. Nach einer Spülung mit PBS decken Sie den Abschnitt zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit Antiserum ab. Behandle negative Kontrolle mit naivem Kaninchen-Antiserum.

Da das Herzgewebe die XI-Immunfluoreszenzfärbung leicht absorbiert, was zu hohen Hintergrundwerten führt, muss die Inkubationskonzentration für verschiedene Antikörpertypen wahrscheinlich optimiert werden.

Zwei Stunden später das Antiserum mit PBS abwaschen. Dann ersetzen Sie die Lösung durch einen sekundären Antikörper und lassen die Objektträger weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Jetzt trage DAPI mit 5 Milligramm pro Milliliter auf und wasche die Objektträger mit PBS. Zum Schluss montieren Sie die Objektträger in FluorSave und bilden Sie sie mit einer konfokalen Mikroskopie.