Ein schneller, bildbasierter Test zur Überprüfung oberflächeninduzierter bakterieller Virulenz

Beginnen Sie mit Platten, die an der Oberfläche angeheftete Bakterien und planktonische oder frei schwebende Bakterien enthalten.

Fügen Sie beiden Proben Amöbenzellen hinzu.

Lege ein Agarose-Pad mit Calcein-AM, einem zelldurchlässigen Farbstoff, über jede Probe.

Entferne überschüssige Flüssigkeit, lasse sie trocknen und brüte die Platten aus.

In der Platte mit oberflächengebundenen Bakterien reguliert der Oberflächenkontakt die Virulenzgene nach oben und exprimiert Toxine.

Diese Toxine stören die Amöbenmembran und verändern ihre Form.

Eine beschädigte Amöbenmembran ermöglicht es, mehr Calcein-AM in das Zytoplasma einzudringen, wo intrazelluläre Esterasen sie zu fluoreszierendem Calcein spalten, was zu seiner Ansammlung führt.

Im Gegensatz dazu bleiben planktonische Bakterien, denen Oberflächenkontakt fehlt, nicht virulent und bleiben die Amöbenmembranen intakt. Dies reduziert den Eintritt von Calcein-AM in die Amöbe und begrenzt die Ansammlung von fluoreszierendem Calcein.

Gesunde Amöben verschlingen auch die nicht-virulenten Bakterien.

Unter einem fluoreszierenden Mikroskop zeigen helle, abgerundete Amöbenzellen eine virulente bakterielle Wechselwirkung an, während schwache, amorphe Amöben auf nicht-virulente bakterielle Wechselwirkungen hinweisen.

Um die Virulenz oberflächengebundener Bakterienzellen zu testen, fügen Sie 10 Mikroliter Amöbenzellen aus den zuvor gewonnenen oberflächengebundenen Bakterienzellen hinzu.

Um die planktonischen Zellen zu isolieren, übergeben Sie 10 Mikroliter der Kultur in eine frische Petrischale.

Als Nächstes wird die Virulenz planktonischer Zellen untersucht, indem 10 Mikroliter Amöbenzellen mit den zuvor gewonnenen planktonischen Bakterien gemischt werden.

Setzen Sie das kleine Agar-Pad sofort auf die passende Bakterien-Amöbenmischung auf die Petrischale.

Entferne dann die überschüssige Flüssigkeit, indem du vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit pipettiert und die Schüssel 20 Minuten trocknen lässt.

Decken Sie das Gericht mit dem Deckel ab und lassen Sie es weitere 40 Minuten bei Zimmertemperatur ausbrüten. Verwenden Sie schließlich ein Fluoreszenzmikroskop, um Bilder von mindestens 100 Amöbenzellen aufzunehmen.