Ethanolresistenztest zur Bewertung der Integrität der Biofilmmatrix

Nehmen wir pathogene, bakterienbasierte Biofilme, die auf Nährstoffagar wachsen.

Der unbehandelte Biofilm enthält dicht gepackte Bakterien innerhalb einer schützenden extrazellulären Matrix.

Der mit Inhibitor behandelte Biofilm weist lose assoziierte Zellen innerhalb einer spärlichen Matrix auf.

Teile jeden Biofilm in zwei Teile, setzt dann eine Hälfte dem Puffer als Kontrolle aus, die andere dem Ethanol, um antimikrobiellen Stress auszuüben.

Im unbehandelten, ethanolexponierten Biofilm reduziert die dichte Matrix die Ethanoldiffusion und begrenzt die Zellpenetration, was zu weniger bakterieller Tötung führt.

Im inhibitorbehandelten, ethanolbesetzten Biofilm ermöglicht die spärliche Matrix dem Ethanol das Eindringen leichter, was zu einer stärkeren bakteriellen Tötung führt.

Zentrifugiere die Röhren und entferne das Überwasser. Fügen Sie Puffer und Sonikat hinzu, um die Zellen zu verteilen.

Plattieren Sie die verdünnten Suspensionen und inkubieren Sie, um das Wachstum lebensfähiger Bakterien zu ermöglichen.

Zähle koloniebildende Einheiten (CFUs); weniger CFUs aus dem inhibitorbehandelten, ethanolbesetzten Biofilm bestätigen, dass die Matrixintegrität für die Ethanolresistenz unerlässlich ist.

Nimm eine saubere Rasierklinge und schneide die Biofilmkolonien mit Hilfe der Vorlage in zwei gleich große Teile. Heben Sie vorsichtig eine Hälfte der Kolonie mit einem sauberen Pfannenwender an und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 500 Mikrolitern PBS.

Nimm die zweite Hälfte der Kolonie und übertrage sie in ein Mikrozentrifugenrohr mit 500 Mikrolitern 50 % Ethanol. Diese werden verwendet, um die Resistenz gegen Sterilisationsmittel zu beurteilen. Anschließend nehmen Sie auch die erste Hälfte der mit D-Leucin behandelten Kolonie und legen sie in PBS.

Dann nehmen Sie die zweite Hälfte dieser Kolonie und übertragen Sie sie in Ethanol. Inkubieren Sie alle Röhre, die die Biofilmhälften enthalten, 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur. Und dann zentrifugiere sie fünf Minuten lang bei 18.000-mal-g.

Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette den Überstandsmittel. Gib 300 Mikroliter PBS hinzu und sonikiere die Zellen dann auf niedriger Stufe mit einem Microtip-Sonikator. Fügen Sie zusätzlich 700 Mikroliter PBS hinzu, was eine Endmenge von einem Milliliter ergibt.

Als Nächstes führen Sie eine serielle Verdünnung von 10 bis minus sieben in PBS durch. Nimm 100 Mikroliter einer der Verdünnungen und inokuliere eine 1,5 % Agar-LB-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt für zwei weitere Verdünnungen pro Probe.

Verteile das Inokulum mit Glasperlen und brüte die Platten dann über Nacht bei 30 Grad Celsius aus. Untersuchen Sie die Platten und zählen Sie die koloniebildenden Einheiten, oder CFU. Nach Berechnung des CFU pro Milliliter Wert wird der Prozentsatz der Überlebenden im PBS im Vergleich zu Ethanolbehandlungen berechnet.