JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:32 Min. • February 26th, 2026
Inkubieren Sie ein Kammerdeckglas mit haftenden Bakterien in einem Medium, das mit Mukoviszidose-Sputumfiltrat abgeleitet und ausschließlich im Medium ergänzt wird.
Das Sputumfiltrat enthält wirtsabgeleitete Komponenten, die bakterielle Signalwege stimulieren und so die Matrixproduktion und die Bildung von Biofilmen auslösen.
Sobald die Biofilme gebildet sind, entsorgen Sie das Medium, das frei schwebende Bakterien und verbleibende wirtsabgeleitete Komponenten enthält.
Waschen Sie mit einem Puffer, um lose angesetzte Bakterien zu entfernen.
Fügen Sie eine Färbemischung mit membrandurchlässigen und membranundurchlässigen fluoreszierenden Farbstoffen hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln.
Der membrandurchlässige Farbstoff durchquert intakte Membranen und kennzeichnet sowohl lebensfähige als auch nicht-lebensfähige Bakterien. Im Gegensatz dazu gelangt der undurchlässige Farbstoff nur in beschädigte Membranen und markiert selektiv nicht lebensfähige Bakterien.
Nach der Inkubation entfern Sie die Färbungslösung und waschen Sie mit dem Puffer, um überschüssige Farbstoffe zu eliminieren und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
Frisches Medium hinzufügen und Bilder mit Konfokalmikroskopie aufnehmen.
Biofilme, die mit Sputumfiltrat gezüchtet werden, zeigen eine erhöhte Dicke, was die Rolle der wirtsabgeleiteten Komponenten bei der Biofilmbildung unterstreicht.
Nach dem Wachstum wird das Medium aus den Kammerbrunnen entfernt und jede Kammer zweimal vorsichtig mit 300 Mikrolitern sterilem PBS gewaschen.
Anschließend wird zur Herstellung der Biofilm-Färbungsmischung 1 Mikroliter jeder im Viabilitätskit bereitgestellten Farbstoff zu jedem benötigten Milliliter Lösung gegeben und die Lösung vermischt.
Die optimale Farb- und Färbezeit wird empirisch für jeden Organismus bestimmt.
Gib 200 Mikroliter der Färbemischung zu jedem Brunnen des kammergefüllten Deckglases. Inkubiere das Deckglas.
Nach der Inkubation wird die Färbemischung aus den Kammern entfernt und jeder Brunnen mit 300 Mikrolitern sterilem PBS gewaschen.
Ersetze das PBS durch frische Medien. Abschließend wird die Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt.