Lichtaktivierte Behandlung bakterieller Biofilme mit einem Photosensibilisator-Vorläufer

Beginnen Sie mit Mikroplattenbohrungen, die Biofilme eines pathogenen Bakteriums enthalten, unterteilt in vier experimentelle Gruppen.

Aspirieren Sie das Medium vorsichtig und spülen Sie mit einem Puffer ab, um nicht haftende Zellen zu entfernen.

Fügen Sie zwei Gruppen einen Puffer mit einem Photosensibilisierer-Vorläufer hinzu, während die übrigen beiden nur den Puffer erhalten.

Inkubieren Sie alle Gruppen im Dunkeln, damit der Vorläufer durch den Biofilm diffundiert, in die Bakterienzellen eindringt und in einen Photosensibilisator umgewandelt wird, der sich im Zytoplasma und in den Membranen ansammelt.

Nach der Inkubation wird eine vorläuferbehandelte Gruppe und eine reine Puffergruppe der Lichtbestrahlung ausgesetzt.

In der vorläuferbehandelten Gruppe regt das Licht den Photosensibilisierer an, der Energie an molekularen Sauerstoff umwandelt und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt.

Das ROS stört Membranen, baut Proteine ab und fragmentiert DNA, was zum bakteriellen Zelltod führt.

Die anderen drei Bedingungen erzeugen kein ROS, da entweder der Vorläufer oder das Licht fehlt und der Biofilm unbeeinträchtigt bleibt.

Um einen Biofilm in einer 96-Well-Platte zu erzeugen, impfen Sie zunächst einen mit minus 80 Grad Celsius aufgetauten Staphylococcus aureus USA dreihundert in drei Biofilme, wobei klinische Stammkulturen in einzelnen 14-Milliliter-Rundbodenröhren mit fünf Millilitern Trypton-Sojabrühe, oder TSB-Medium, in einem 37-Milliliter-Inkubator mit nächtlichem Schütteln entsteht. Wenn die Kulturen die stationäre Phase erreicht haben, zentrifugieren Sie die Bakterienzellen und suspendieren die Pellets und PBS auf eine Konzentration von 2 mal 10 auf die neunte Koloniebildung pro Milliliter. Verdünnen Sie diese bakteriellen Suspensionen im Verhältnis von 1 bis 200 und TSB-Medium, ergänzt mit null Komma fünf Prozent Glukose, und Säen Sie 200 Mikroliter Bakterienzellen pro Bohrloch in drei Brunnen pro Stamm pro Versuchsgruppe in einer Polystyrol-Zellkultur, behandelt mit 96 Brunnen-Mikroplatten für eine 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius, mit Sauerstoff, ohne zu zittern.

Am nächsten Tag die Brunnen vorsichtig dreimal mit PBS waschen, ohne die Biofilme zu stören. Gib als Nächstes 200 Mikroliter frisch zubereitetes ALA in die entsprechenden Versuchsbrunnen und stellst die Platte eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius unter Lichtschutz. Anschließend bestrahlen Sie die Platte mit einer Leuchtdiode mit einer Lichtintensität von 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter für eine Stunde.