Probenvorbereitung und Bildgebung fluoreszenzmarkierter Bakterien

Beginnen Sie mit einer großen Glasfolie, mit kleineren Objektträgern, die an beiden Kanten in einer doppelten Schicht platziert werden.

Gieße geschmolzene Agarose in den Raum und decke ihn mit einem weiteren großen Glasdias ab.

Beruhige das Setup, um die Agarose zu verfestigen.

Entferne die Glasscheiben und schneide die Agarose in kleine Polster.

Platziere die Agarose-Pads in einen klebevollen Rahmen, der an einem Schlitten befestigt ist.

Nehmen Sie eine Kultur pathogener Bakterien, die genetisch verändert wurden, um ein fluoreszenzmarkiertes Sekretionssystem auszudrücken, das für die Infektion des Wirts unerlässlich ist.

Verwenden Sie ein dichtes bakterielles Pflaster und lassen Sie es in Wasser aufhängen.

Wirbel, um die Bakterien gleichmäßig zu verteilen.

Trage die Suspension auf das Agarose-Pad auf, um die Bakterien zu immobilisieren.

Schließen Sie sie mit einem Deckdeckel ab, um die Flüssigkeitszufuhr zu erhalten.

Bei Hellfeldbeleuchtung wählen Sie ein Feld von Zellen für die Bildgebung aus.

Optimieren Sie die Mikroskopeinstellungen, um Photobleaching zu reduzieren und die Signalempfindlichkeit zu erhöhen.

Wechsle zum Fluoreszenzkanal, um die fluoreszenzmarkierten Bakterien zu erkennen.

Beginnen Sie damit, Agarose-Pads für die Lebendzellbildgebung herzustellen. Bereiten Sie etwa 30 Milliliter 1 % niedrigschmelzende Agaroselösung in Wasser vor und lassen Sie sie etwa 90 Sekunden in einer Glasflasche in der Mikrowelle auf, wobei Sie sie gelegentlich schwenken, bis die Agarose vollständig gelöst ist.

Platzieren Sie zwei 22 mal 22 mal 0,15 Millimeter große Glasschlitten an den Rand eines 25 mal 75 mal 1,1 Millimeter großen Glasverschlusses, einer übereinander. Dann stapeln Sie zwei weitere der kleineren Folien an der anderen Seite. Pipettieren Sie etwa 1 Milliliter der geschmolzenen Agarose in den mittleren Schlitten zwischen den beiden oberen Glasträgern und setzen Sie einen weiteren großen Schlitten auf die geschmolzene Agarose, wobei Sie darauf achten, dass sich Luftblasen nicht bilden.

Kühlen Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius ab und schneiden Sie das Pad dann mit einem Skalpell oder Rasiermesser vorsichtig in kleine Quadrate. Befestigen Sie einen doppelseitigen Kleberahmen an einem 25 mal 75 mal 1,1 Millimeter großen Glasschlitten und setzen Sie mehrere Polster auf den Schlitten. Lösen Sie einen schweren Fleck Legionella pneumophila in 1 Milliliter doppelt destilliertes Wasser auf.

Dann vortexen und 2 bis 3 Mikroliter der Verdünnung auf die Pads pipetten. Setzen Sie vorsichtig eine 58 mal 24 mal 0,15 Millimeter große Abdeckung über den Kleberahmen. Wählen Sie Zellen für die Bildgebung mit Hellfeldbeleuchtung aus.

Im Aufnahmefenster der Mikroskopsoftware stellen Sie dann den ND auf 180 Grad und das Binning auf 2 mal 2 an. Verwenden Sie den 488-Nanometer-Kanal, um die Probe für 500 bis 1000 Millisekunden zu belichten, und validieren Sie die Spezifität der Fluoreszenz, indem Sie unmarkierte Legionella-Pneumophila mit denselben Parametern abbilden.