JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:03 Min. • March 31st, 2026
Nehmen Sie eine Bakterienkultur, die Blattgewebe infizieren kann.
Kratze die Kolonien ab und lasse sie in einer Salzlösung aufhängen.
Messen Sie die optische Dichte, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen, und verdünnen Sie dann auf den gewünschten OD.
Führen Sie serielle Verdünnungen durch, um die endgültige Inokulumkonzentration zu erreichen.
Fügen Sie ein Tensid hinzu, um die Oberflächenspannung zu verringern und eine gleichmäßige Ausbreitung der Bakterien auf dem Blatt sicherzustellen.
Übertragen Sie die Suspension in eine Petrischale.
Als Nächstes legen Sie zwei Holzstöcke über die Oberseite eines Arabidopsis-Topfs .
Drehen Sie die Pflanze über die Schale und tauchen Sie die Blätter in die Suspension.
Stelle das Setup in eine Vakuumkammer und führe einen Vakuumimpuls an
Das aufgebrachte Vakuum entfernt Luft aus dem Blattgewebe durch natürliche Öffnungen.
Das Freisetzen des Vakuums stellt den atmosphärischen Druck wieder her und zwingt Bakterien in die Blätter.
Wiederholen Sie die Impulse, um maximale Infiltration zu erreichen.
Nimm den Topf ab. Dann tupfen Sie das überschüssige Inokulum ab.
Die bakteriell infizierten Blätter von Arabidopsis sind bereit für eine nachgeschaltete Analyse.
Strebe den Glycerolbestand des interessanten Pseudomonas syringae-Stamms von minus 80 Grad Celsius auf eine mit geeigneten Antibiotika ergänzte LB-Platte aus. Inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden. Kratzen Sie die bakterielle Biomasse ab und suspendieren Sie sie in fünf Millilitern 10-millimolaren Magnesiumchlorid.
Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern und stellen Sie sie auf 0,1 ein, indem Sie 10-millimolaren Magnesiumchlorid hinzufügen. Führen Sie serielle Verdünnungen mit 10-millimolarem Magnesiumchlorid durch, um eine endgültige Inokulumkonzentration von 5 mal 10 bis zum fünften CFU pro Milliliter zu erhalten. Dann bereiten Sie 200 Milliliter Inokulum für die Arabidopsis-Pflanzen und 50 Milliliter für die Bohnenpflanzen vor.
Vor der Impfung wird das Tensid Silwet L-77 zu einer Endkonzentration von 0,02 % für die Bohnenimpfung und 0,01 % für Arabidopsis hinzugefügt. Für die Arabidopsis-Infiltration setzen Sie zwei Holzstäbchen, die ein X bilden, über den Topf und legen Sie den Topf nach unten auf eine 14 Zentimeter große Petrischale mit 200 Millilitern Inokulum. Für die Impfung von Bohnenblättern werden die Pflanzen und die Inokulumlösung in eine Vakuumkammer eingefügt und das Blatt in ein 50-Milliliter-konisches Zentrifugenrohr mit dem Inokulum eingeführt.
Gib einen Puls von 500 Millibar für 30 Sekunden, um die Blätter zu infiltrieren. Lassen Sie die überschüssige Inokulumlösung mit einem Stück Papier abtropfen und bringen Sie die Pflanzen zurück in ihre entsprechende Wachstumskammer.