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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:36 Min. • March 31st, 2026
Nehmen Sie eine Suspension eines pathogenen Bakteriums, das aus einer infizierten Pflanze isoliert wurde.
Das bakterielle Genom enthält eine transkriptionelle Fusion, bei der der Promotor eines virulenzregulierenden Gens auch die Expression eines nachgelagerten, promoterlosen fluoreszierenden Proteingens vorantreibt.
Während der Pflanzeninfektion löst die Aktivierung des Promotors die Produktion der regulatorischen und fluoreszierenden Proteine aus.
Das regulatorische Protein aktiviert Virulenzgene, während die Fluoreszenz eine messbare Anzeige der Virulenzaktivierung liefert.
Zentrifugiere die Zellen, entsorge den Supernatant und suspendiere dann wieder, um eine konzentrierte Suspension zu erhalten.
Platzieren Sie einen Tropfen auf einen Deckzettel und legen Sie ein Agarose-Pad darüber, um die Zellen zu verteilen und zu immobilisieren.
Nehmen Sie ein Brightfield-Bild auf, um alle Bakterienzellen zu identifizieren, dann ein Fluoreszenzbild, um Einzelzell-Fluoreszenz zu erkennen.
Kombinieren Sie beides, um Unterschiede in der Fluoreszenzintensität zu visualisieren, die Subpopulationen mit hoher, niedriger oder keiner Virulenzgenexpression offenbaren.
Diese phänotypische Variation spiegelt eine adaptive Strategie wider, die das Überleben von Bakterien während der Pflanzenkolonisierung verbessert.
Für eine Einzelzellanalyse bereiten Sie eine 1,5%ige Agaroselösung in destilliertem Wasser vor. Nach dem Schmelzen fügen Sie genug Volumen hinzu, um den Raum zwischen zwei nebeneinander liegenden Mikroskopiumsobjekten zu füllen, und legen Sie einen weiteren Objektträger darauf. Lass sie 15 Minuten fahren und entferne vorsichtig den auf der Oberfläche platzierten Schlitten.
Mit einer Klinge schneiden Sie das Agarose-Pad vor der Anwendung in 5 Millimeter mal 5 Millimeter große Stücke. Zentrifugiere parallel 1 Milliliter der vom Apoplast extrahierten Bakterien. Entfernen Sie vorsichtig das Überstandsmittel mit einer Pipette und lassen Sie das Pellet in 20 Mikrolitern Wasser aufhängen, um die Zellen zu konzentrieren.
Setzen Sie einen 2-Mikroliter-Tropfen der konzentrierten Zellen auf einen 0,17-Millimeter-Abdecker und decken Sie den Tropfen mit einem Stück Agarose-Pad ab. Visualisieren Sie die bakterielle Präparation unter dem konfokalen Mikroskop, um grüne fluoreszierende Bakterien mit spezifischen Lasern zu identifizieren. Identifizieren Sie alle Bakterien mit dem Hellfeld und führen Sie beide Felder zusammen.