Extraktion der Gesamt-DNA aus Blättern zur Erkennung bakterieller Infektionen

Beginnen Sie mit kleinen Stücken gekühlten Blattgewebes, in denen das Phloem mit einem bakteriellen Erreger infiziert ist.

Setzen Sie die Stücke in einen Mörser mit flüssigem Stickstoff, um die Aktivität der DNA-abbauenden Nukleasen zu hemmen.

Mahlen, um die Zellen mechanisch zu zerstören und intrazelluläre Komponenten freizusetzen.

Verwende einen gekühlten Pfannenwender, um das Pulver zu übertragen, gib Lysepuffer hinzu und wirbel die Suspension vortex.

Inkubieren, um Pflanzenkerne und Bakterienzellen zu lysieren, wobei DNA und RNA freigesetzt werden, während Proteine denaturiert werden.

Fügen Sie RNase hinzu und inkubieren Sie, um RNA abzubauen.

Fügen Sie einen Protein-Präzipitationspuffer hinzu, um die Proteine zu aggregieren, und zentrifugieren Sie dann, um sie zu trennen.

Übertragen Sie den überlagernden Pflanzen- und Bakterien-DNA auf Isopropanol, um die DNA als fadenartige Stränge auszufällen.

Zentrifugieren, um DNA zu sammeln und das Supernatant zu entsorgen.

Mit Ethanol waschen, dann zentrifugieren und das Supernatant entsorgen.

Die DNA an der Luft trocknen, dann einen Rehydrationspuffer hinzufügen und inkubieren, um sie aufzulösen.

Die DNA-Proben sind nun bereit für den nachgelagerten PCR-basierten Erregernachweis.

Schneiden Sie mit einer sauberen Schere ein ganzes frisches Blatt von einem Zitrusbaum ab und legen Sie sie in eine saubere Plastik-Sandwichtüte. Anschließend kühlen Sie einen Mörser und Stößel, indem Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoffs hinzufügen. Anschließend verwenden Sie die Schere, um kleine Stücke des Blattgewebes von etwa einem Quadratzoll zu schneiden.

Geben Sie die Blattstücke sofort in den Mörtel, um sie einzufrieren. Beginnen Sie schnell, das Blattgewebe mit dem Mörser zu mahlen, bis der flüssige Stickstoff verdunstet ist und ein feines grünes Pulver zurückbleibt. Als Nächstes kühlen Sie einen Metallpfannenwender 10 bis 15 Sekunden in flüssigem Stickstoff. Dann benutze den kalten Pfannenwender, um das gemahlene Gewebe aus dem Mörtel in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr zu schöpfen. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um 600 Mikroliter Kern-Lyselösung zur Probe hinzuzufügen. Dann wirbelt die Probe ein bis drei Sekunden lang vortex. Inkubieren Sie das Rohr bei 65 Grad Celsius in einem Wasserbad für 15 Minuten.

Nach Ablauf der Inkubationszeit verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um 3 Mikroliter RNase-Lösung zum Lysat hinzuzufügen, um RNA zu entfernen. Dann mischen Sie den Inhalt des Röhrchens zwei- bis fünfmal um. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten in einem Kabinett-Inkubator. Nach 15 Minuten werden 200 Mikroliter Protein-Ausfällungslösung zur Probe hinzugefügt. Wirbel das Rohr mit hoher Geschwindigkeit 20 Sekunden lang vortex.

Als Nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 g für 3 Minuten. Während der Zentrifugation werden 600 Mikroliter Isopropanol bei Zimmertemperatur in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr gegeben. Nach Abschluss der Zentrifugation wird das Überstandsmittel vorsichtig aus dem Zentrifugenrohr in das Rohr mit Isopropanol entnommen. Wirf das Pellet weg.

Invertiere das Rohr, damit die DNA wie ein fadenartiger Strang sichtbar wird. Als Nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 g für eine Minute bei Raumtemperatur.

Kippen Sie das Supernatant nach der Zentrifugation ab. Dann geben Sie 600 Mikroliter 70 % Ethanol zum Pellet. Drehen Sie das Rohr mehrmals um, um das Pellet zu waschen. Zentrifugiere das Rohr bei 13.000 g für 1 Minute. Nach Abschluss der Zentrifugation wird das Supernatant vorsichtig aspiriert. Dann drehen Sie das Rohr mit offenem Deckel auf einem saugfähigen Papier, um es 15 Minuten an der Luft zu trocknen. Nach dem Trocknen geben Sie dem Pellet 100 Mikroliter DNA-Rehydrationslösung hinzu. Inkubieren Sie die DNA-Suspension eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius in einem Wasserbad.