Name: Dissection of Human Glaskörper Elemente für Proteomanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Lernen Sie die Präparation des menschlichen Glaskörpers für Proteomanalysen. Diese Methode zeigt die Präzisionsdissektion von Substrukturen wie Anterior Hyaloid und Vitreous Base in postmortalen Augen.

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Die Finanzierung wurde von Fight for Sight zur Verfügung gestellt. Die Gewebe wurden von der Iowa Lions Eye Bank erhalten.

1. Anterior Segment Dissection. <ol><li> Die Hornhaut wird zunächst durch einen Einschnitt am Limbus in die Vorderkammer mit einem 15 ° Klinge (Abbildung 1) entfernt. Dann eine Klinge von gekrümmten Hornhaut-Sklera-Schere ist in die Vorderkammer eingeführt. Umlaufende Schnitte in der Hornhaut gemacht, unmittelbar vor dem Limbus. </li><li> 0,12 Colibri Pinzette und Schere Westcott werden verwendet, um die Iris umfänglich anterior des Ziliarkörpers geschnitten. </li><li> Der Linsenkern wird mit 0,12 Colibri Zange oder einem 15 °-Klinge (superscharfen) und der Hirnrinde und Kapsel mit einer Pinzette entfernt. </li></ol> 2. Glaskörper-Core Aspiration. <ol><li> Ein 23-Gauge-Nadel auf einer 5-ml-Spritze ist in der Mitte eingesetzt Glaskörper (Abbildung 1). </li><li> Etwa 1 ml oder mehr glasigen Kern ist vorsichtig abgesaugt. </li><li> Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. </li></ol> 3. Anterior hyaloiden Dissection. <ol><li> Der vordere hyaloidea ist als semi-transparent Ring durch die Anpassung des einfallenden Lichts von einem Schwanenhals Mikroskop Licht gesehen. Vorherige Aspiration des Glaskörpers Kern trennt den vorderen hyaloiden von anderen Strukturen zur leichteren Identifizierung. </li><li> Das Blatt aus elastischem Gewebe wird vorsichtig vom Ziliarkörper mit Colibri oder Kornzange gezogen und schneiden Sie mit Vannas Schere. Dieses Manöver wird wiederholt. </li><li> Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. </li></ol> 4. Glaskörperbasis Dissection. <ol><li> Mit 0,12 Pinzette auf die Augenmuschel zu stabilisieren, werden Westcott Schere "Blume" das Auge, indem sie vier gleichmäßig verteilte Spannungsarmglühen Schnitte aus dem Ziliarkörper in Richtung des Sehnervenkopfes eingesetzt. </li><li> Die Pars plicata des Ziliarkörpers (Abbildung 2) ist aus jedem der Quadranten mit Westcott Schere entfernt. </li><li> Der Glaskörper Basis wird dann auf beiden Seiten der Ora serrata mit einer Pinzette über die pars plana und der Netzhaut (Abbildung 2) erfasst. </li><li> Kontinuierliche Traktion auf den Glaskörper Basis ist mit der Zange angewendet. Sequential Schneiden mit Westcott Schere extrahiert eine semi-transparente Gewebe mit einer "Perlenkette" Erscheinungsbild, wie es ist herausgeschnitten. </li><li> Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. </li></ol> 5. Vitreous Cortex Removal. <ol><li> Die Pars plana ist aus jedem der Quadranten mit Westcott Schere durch Abschneiden der Broschüre ca. 3-mm hinter der Ora serrata (Abb. 2) herausgeschnitten. </li><li> Zwischen dem Gewebe Flugblätter, wird der Glaskörper Kortex visualisiert als halb transparente Folie. </li><li> Die elastische Folie ist entweder mit 0,12 Pinzette gefaßt oder über die Zugehörigkeit zu einer Weck-Cel chirurgischen Schwamm. Der Glaskörper Kortex wird dann von der Netzhaut und zog ausgeschnitten mit Westcott Schere (Abbildung 1). </li><li> Die Probe wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. Alle Proben werden bei -80 ° C bis zum Experimentieren genutzt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Gewebeproben können durch eine Vielzahl von Methoden für bestimmte Experimente verarbeitet werden. In unserem Fall wurden die Proben für Protein-Analyse durch SDS-PAGE (Abbildung 3) vorgelegt. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Querschnitt des menschlichen Auges darstellen verschiedenen Teilstrukturen des Glaskörpers. Die vorderen Glaskörper ist eine dünne kollagenen Schicht bezeichnet den vorderen hyaloidea. Der Glaskörper Kern umfasst das gesamte zentrale Bereich des Glaskörpers. Dieser Teil des Glaskörpers ist wässrigen im Gegensatz zu den Glaskörper Basis, die viskos genug, um mit einer Pinzette fassen und ist fest mit dem darunter liegenden Ziliarkörper und Retina befestigt ist. Umfasst den Glaskörper Kern ist eine sehr dünne kollagene Shell aufgerufen Glaskörper Kortex. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Glaskörperbasis Anatomie. Der Glaskörper Basis ist eine semi-transparente Unterbau des Glaskörpers an der Ora serrata (weiße Pfeile), die die Trennlinie Trennung des Ziliarkörpers und der Netzhaut liegt. Der vordere Rand des Glaskörpers Basis erstreckt sich über die pars plana (weiße Linie) des Ziliarkörpers. Der hintere Rand des Glaskörpers Basis erstreckt 2-3 mm hinter der Ora serrata (weiß Bindestrich). Verbrauchsteuerpflichtige die Glaskörperbasis sind Pinzette verwendet, um das Gewebe zu erfassen und ziehen Sie sie weg von der zugrunde liegenden Ziliarkörper und Retina. Einmal erhöht, Westcott Schere werden verwendet, um an der Basis abgeschnitten. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Eindimensionale SDS-PAGE des Glaskörpers Elements. Gesamt-Protein-Konzentrationen für den vorderen hyaloidea, Glaskörperbasis, vitreous Kern und Glaskörper Kortex wurden 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / ml. Gel-Elektrophorese wurde bei 200 kV für 45 Minuten durchgeführt, gefärbt mit Flamingo (Bio-Rad), und visualisiert mit Hilfe eines VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Die Profile für die verschiedenen Gewebe zeigen mehrere ähnliche Bands, aus der entweder konserviert oder Cross-kontaminierenden Proteinen, sowie einzigartige Bands (Stern), was darauf hinweist unterschiedlich lokalisierte Proteine.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

Der Glaskörper ist eine semi-transparente Gel, dessen molekulare Zusammensetzung ist weitgehend unverstanden, vor allem auf der Ebene der Unterkonstruktion: Der Glaskörperbasis, Kern, Kortex und anterioren hyaloidea. Der Glaskörper Kern enthält Kollagene II, V, IX und XI, zusammen mit Chondroitinsulfat Proteoglykane, Heparansulfat Proteoglykane und Hyaluronsäure. 1,2 Protein-Biomarkern in den Glaskörper Kern haben mit Krankheiten wie diabetische Retinopathie in Verbindung gebracht worden. 3-5 Wie Diese Proteine ​​sind unterschiedlich in den einzelnen Substrukturen ausgedrückt, und in vielen Fällen das spezifische Protein-Identitäten sind nicht bekannt. Diese Angaben können Einblick in die Herkunft der Proteine ​​mit spezifischen vitreoretinale Erkrankungen geben und helfen Ziel zukünftige Therapien. Obwohl die optimale post mortem Intervall für Gewebedissektion wurde nicht bestimmt, so kann Proteinabbau beeinträchtigen nachgeschaltete Experimente. Zum Beispiel ist die Immunhistochemie in 12-Stunden post mortem Augen betroffen und einige spezifische Enzymaktivitäten können innerhalb weniger Stunden reduziert werden (unveröffentlichte Beobachtung). Alle Gewebe in dieser Studie waren zwischen 2 und 8 Stunden nach dem Tod, ohne wesentliche Änderungen in der Proteinexpression oder der Eignung für die Proteomik analsyis gesammelt. Der flüssige Stickstoff Einfrieren Verfahren zur Haltbarmachung über Fixierung gewählt, um kleine Veränderungen in der Proteinstruktur von Fixativ Vernetzung, die in anderen Geweben wurde durch LC-MS/MS demonstriert verhindern. 6 Proteomic Studien werden sich auf die Fähigkeit, genau ab sezieren den verschiedenen Kompartimenten des Glaskörpers, wie in diesem Video Experiment gezeigt. Wir haben die Dissektionstechnik mit 1-dimensionale SDS-PAGE bestätigt. Wie unsere Ergebnisse zeigen, gibt es unterschiedlich Proteine ​​in den verschiedenen Glaskörper Unterkonstruktionen ausgedrückt. Die Identifizierung dieser Proteine ​​liefert ein detaillierteres Verständnis der Glaskörper Abschottung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td></tr><tr><td> 0,12 Pinzette </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5-ml-Spritze </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Gerade Kornzangen mit Zacken </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> 23 Gauge Nadel </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri Zange </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo abgewinkelt Hornhaut Schere </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas Curved Kapsulotomie Scissors </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgischen Speere </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Westcott Curved Tenotomie Scissors </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

dissection of human glaskörper elemente für proteomanalyse

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Der Glaskörper ist eine optisch klare kollagenen extrazellulären Matrix, die das Innere des Auges und liegt über der Netzhaut füllt. 1,2 Abnormal Interaktionen zwischen Glaskörper Unterkonstruktionen und der Netzhaut zugrunde liegen mehrere vitreoretinale Krankheiten, einschließlich Netzhauteinriss und Loslösung, Macular Pucker, Makula-Loch, altersbedingter Makula-Degeneration, vitreomacular Traktion, proliferative Vitreoretinopathie, proliferative diabetische Retinopathie, und erbte vitreoretinopathies. 1,2 Die molekulare Zusammensetzung des Glaskörpers Unterkonstruktionen ist nicht bekannt. Da der Glaskörper ist transparent mit begrenzten chirurgischen Zugang, ist es schwierig gewesen, seine Unterkonstruktionen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Wir entwickelten ein Verfahren zur Trennung und zur Erhaltung dieser Gewebe für Proteomik und biochemische Analyse. Die Dissektionstechnik in diesem experimentellen Video zeigt, wie Glaskörperbasis, anterior hyaloidea, glasigen Kern und Glaskörper Kortex von postmortalen menschlichen Augen zu isolieren. Eindimensionale SDS-PAGE-Analysen der einzelnen Glaskörper Komponente gezeigt, dass unsere Dissektionstechnik in vier einzigartigen Protein-Profilen, die der jeweiligen Unterkonstruktion des menschlichen Glaskörpers geführt. Identifizierung von differentiell compartmentalized Proteine ​​wird zeigen, Kandidaten-Moleküle zugrunde liegenden verschiedenen vitreoretinale Krankheiten.

Dieses Video zeigt eine effektive Technik zur Differenzierung und seziert die verschiedenen semi-transparente Strukturen des menschlichen Glaskörper in post mortem Augen.

Dissection of Human Glaskörper Elemente für Proteomanalyse

Der Glaskörper ist eine optisch klare, kollagenhaltige extrazelluläre Matrix, die das Augeninnere ausfüllt und die Retina überdeckt. 1,2 Abnormale Interaktionen ...

Das Glask&ouml;rper ist eine optisch klare extrazellul&auml;re Matrix, die das Innere des Auges ausf&uuml;llt. Er kann in mehrere Unterstrukturen unterteilt werden, darunter die vordere Hyaloidea hinter der Linse, die Glask&ouml;rperbasis an der vorderen Retina, die Glask&ouml;rperkapsel, die eine elastische H&uuml;lle bildet, und der zentrale Glask&ouml;rperkern. Um den Glask&ouml;rper zu pr&auml;parieren, m&uuml;ssen wir zun&auml;chst das vordere Segment entfernen.Eine äußerst scharfe Klinge wird verwendet, um die Hornhaut am Limbus einzuschneiden. Anschließend werden Hornhaut-Sklera-Scheren benutzt, um die Hornhaut unmittelbar vor dem Limbus zu durchtrennen. Die Regenbogenhaut wird mit einer gebogenen Schere disseziert, indem sie von ihrer Fläche weggezogen wird.Durch sanften Druck auf den Augapfel kann der Kern herausgedrückt werden. Um den Glaskörperkern zu entfernen, aspirieren Sie den überwiegend flüssigen Glaskörper mit einer 23-Gauge-Kanüle an einer 5-cc-Spritze. Der vordere Glaskörper wird als dünne, transparente Membranstruktur sichtbar, die mit einer Pinzette erfasst werden kann.Es handelt sich um eine elastische Struktur direkt hinter der Linse. Der innere Kreis ist das Ligamentum hyaloideum. Mit einer Schere werden das Glaskörperblatt durchtrennt, während mit einer Pinzette Zug ausgeübt wird.Das Lat-Gewebe kann in ein afu-Röhrchen überführt werden, und der Vorgang wird wiederholt, bis das gesamte Gewebe präpariert ist. Um auf die verbleibenden Glaskörper-Substrukturen zuzugreifen, muss das Auge mit gebogenen Westcott-Scheren geöffnet werden. Jede der Klappen wird mit einer Pinzette in einer Petrischale beiseitegehalten.Dieses Bild zeigt die Anatomie der Glask&ouml;rperbasis, ein d&uuml;nnes, transparentes Gewebe, das die Ora serrata &uuml;berspannt. Die Ora serrata ist die Grenzlinie zwischen dem vorderen Ziliark&ouml;rper und der hinteren Netzhaut. Im Gegensatz zu anderen Teilen des Glask&ouml;rpers haftet die Glask&ouml;rperbasis fest am darunterliegenden Ziliark&ouml;rper und an der Netzhaut, sodass das Ziehen mit einer Pinzette tats&auml;chlich das Gewebe anhebt.Um die Glask&ouml;rperbasis zu isolieren, entfernen wir zuerst die Pars plicata mit einer Pinzette und Wescott-Scheren. Die Pars plicata ist dieser kleine Bereich mit Rillen. Um dann die Glask&ouml;rperbasis zu isolieren, schneiden Sie zwei bis drei Millimeter hinter der Aura mit der Wescott-Schere, w&auml;hrend Sie das Auge mit der Pinzette stabilisieren, halten Sie die Glask&ouml;rperbasis mit der Pinzette fest und f&uuml;hren Zug darauf aus und schneiden nacheinander mit der Wescott-Schere.Es zeigt sich ein Perlenschnur-artiges Aussehen, während die Glaskörperbasis entfernt wird, und man kann beobachten, wie diese extrazelluläre Matrix Proteine möglicherweise kompartimentalisiert. Verschiedene Techniken können verwendet werden, um die Hülle des Glaskörpers zu präparieren. Der Kontakt mit einem WEX-Zell-Schwamm hebt den Kortex an.Eine Kante der Kortex kann zwischen den Blättchen wie hier gezeigt gefunden werden. Verwenden Sie erneut die Pinzette, um Zug zu erzeugen, und greifen Sie zu den VanNess-Scheren, um die Glaskörperkortex schrittweise zu durchtrennen. Die Kortex kann auch vom Sehnervkopf abgehoben werden, und hier werden größere Westcot-Scheren verwendet, um die Kortex zu dissezieren, während sie vorsichtig von der Oberfläche der Retina abgezogen wird.Die Proben können anschließend in ein Mikrogefäß gegeben und für spätere proteomische Analysen aufbewahrt werden.

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Forschung

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Medizin

Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für unser Verständnis der Entwicklung und Alterung. Die anatomische Organisation des Primas Netzhaut kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern.

Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye

Die Dissektionstechnik zeigt Ausnehmen des Glaskörpers, der Netzhaut und Linse aus dem Auge der Maus, die Trennung durch Zentrifugation und Charakterisierung mit Protein-Assays.

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

Neuronale Netzhaut einer Maus im Alter von 8 Tagen auf einem 4% igen Gelatineblock. Nach Isolierung der Photorezeptorschicht (200 um) durch Vibratom werden die Photorezeptoren nach der mechanischen und enzymatischen Spaltung der Kultur beimpft. Die Photorezeptorschicht kann für die molekulare, biochemische Analysen oder Transplantation verwendet werden.

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine effektive Technik zur Isolierung des ganzen, intakten Glaskörperkerns und der Rinde aus post mortem enukleierten Schweineaugen zu zeigen.

Ganze Glaskörper Dissection für Vitreodynamic Analysis

Die menschliche Netzhaut besteht aus funktional und molekular verschiedene Regionen, einschließlich der Fovea, der Makula und der peripheren Netzhaut. Hier beschreiben wir eine Methode mit Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge zu zerlegen und diese verschiedenen retinalen Regionen für nachgeschaltete Proteomic Analysen zu sammeln.

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Hier wird ein Verfahren zur Extraktion zellfreier DNA aus Glaskörper und Kammerwasser etabliert, um molekulare Studien zur Diagnose des vitreoretinalen Lymphoms durchzuführen. Die Methode bietet die Möglichkeit, gleichzeitig DNA aus der zellulären Komponente der Probe zu extrahieren oder für zusätzliche Tests zu reservieren.

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