Herstellung von Pseudoviren mittels Plasmid-Transfektion in menschlichen Zellen

Beginnen Sie mit einem Kulturkolben, der humane embryonale Nierenzellen in einem nährstoffreichen Medium enthält.

Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das Chloroquin enthält, um die Plasmidübertragung in die Zellen zu verbessern.

Nehmen Sie eine Mischung aus Plasmiden, die Influenza-Oberflächenproteine, lentivirale Kernproteine und das lentivirale Genom kodieren, zusammen mit Calciumphosphat. Inkubieren Sie, um Calciumphosphat–DNA-Komplexe zu bilden.

Fügen Sie die Mischung den Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie, um dem Komplex den Eintritt in die Zellen über Endozytose zu ermöglichen. Chloroquin fördert die endosomale Freisetzung der Plasmid-DNA.

Innerhalb der Zelle induziert die Plasmid-DNA die Expression sowohl von Influenza- als auch von Lentiviralbestandteilen.

Ersetzen Sie das Medium, um überschüssige Komplexe zu entfernen.

Brüten Sie, um die Assemblierung der viralen Komponenten und deren Ablösung als Pseudoviren zu ermöglichen, die in das Kulturmedium freigesetzt werden.

Sammlen Sie das Medium, das die Pseudoviren enthält, und zentrifugieren Sie es, um zelluläre Trümmer zu pelletieren.

Sammeln Sie das pseudovirushaltige Überstandmedium und lagern Sie es bei niedrigen Temperaturen für nachgeschaltete Assays.

Stellen Sie zunächst eine Einzelzell-Suspension von HEK 293FT-Zellen in vollständigem DMEM-Medium her. Geben Sie zehn Milliliter der Einzelzell-Suspension in einen T75-Flasche und inkubieren Sie bei dreiunddreißig Grad Celsius.

Zwei Stunden vor der Transfektion ersetzen Sie das alte Medium durch zehn Milliliter frisches komplettes Medium mit Chloroquin. Mischen Sie die Reagenzien und die Plasmid-DNA, wie in der Arbeit beschrieben. Anschließend übertragen Sie diese Mischung in das Medium über den Zellen und schwenken vorsichtig.

Nach der Inkubation das Medium durch fünfzehn Milliliter frisches, komplettes DMEM-Medium ersetzen. Nach fünfundsechzig Stunden das Überstandmedium durch Zentrifugation gewinnen. Den Überstand sammeln und portionieren.