Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:01 Min. • July 31st, 2026
Begin with a culture of epithelial cells infected with a pseudovirus, which is a genetically engineered non-virulent virus.
The pseudovirus carries a luciferase reporter gene that enables expression of the luciferase enzyme in the infected host cells.
Remove the media from the well.
Wash with a buffer to remove any residual media.
Add a lysis buffer to the well that aids in cell lysis.
Incubate at an ultra-low temperature to freeze the cells.
Thaw the cells at room temperature.
The freezing and thawing process ensures complete cell lysis, releasing intracellular components, including the luciferase enzyme.
Transfer the cell lysate to an opaque plate to reduce the background signal during luminescence measurement.
Add a substrate.
The luciferase enzyme in the lysate reacts with the substrate, emitting light.
Measure the emitted luminescence to quantify the pseudovirus infection level.
To perform the luciferase assay, wash the cells by removing the medium carefully and rinsing it with 200 microliters of PBS.
Remove as much of the PBS as possible, then add 50 milliliters of the lysis buffer to each well. On the next day, equilibrate the plates at room temperature for two hours, then rock the culture plates several times and transfer all the cell lysates to opaque 96 well plates. Add 50 microliters of the substrate to each plate and mix it well.
Record the luciferase titers of the pseudo virus by using the luminometer.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein auf Luciferase basierendes Assay zur Quantifizierung der Infektion durch pseudotypisierte H5-Vogelgrippeviren in epithelialen Zellen demonstriert. Das Protokoll verwendet ein genetisch verändertes Pseudovirus, das ein Luciferase-Reportergen trägt, wodurch eine empfindliche Detektion der Infektionsgrade durch Lumineszenzmessung nach Zelllyse ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Pseudotyptische Viren sind nicht virulente, genetisch veränderte Viren, die für sichere Infektionsstudien verwendet werden.
- Luciferase-Reportergen-Assays liefern eine quantitative Auswertung der Virusinfektion in Wirtszellen.
- Die Messung der neutralisierenden Antikörperaktivität gegen aviäre Influenza ist wichtig für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapeutika.
- Eine genaue Quantifizierung der Infektion ist entscheidend, um antivirale Reaktionen zu bewerten.
Zweck der Studie
- Herstellung von pseudotypisierten H5-Vogelgrippeviren mithilfe einer Calciumphosphat-Transfektionsmethode.
- Entwicklung eines auf Luciferase basierenden Assays zur Quantifizierung der Pseudovirusinfektion in epithelialen Zellen.
- Möglichmachung der Messung der neutralisierenden Antikörperaktivität gegen das Pseudovirus.
Verwendete Methoden
- Infektion von Epithelzellen mit einem Luciferase-codierenden Pseudovirus.
- Entfernung des Mediums und Waschen der Zellen mit PBS, um verbleibende Bestandteile zu eliminieren.
- Zelllyse unter Verwendung eines Lysepuffers, gefolgt von Gefrier-Tauch-Zyklen zur Sicherstellung einer vollständigen Lyse.
- Übertragung des Lysats in undurchsichtige 96-Well-Platten, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
- Zugabe des Luciferase-Substrats und Messung der Lumineszenz mittels eines Luminometers.
Hauptergebnisse
- Der Luciferase-Assay liefert eine empfindliche und quantitative Messung der Pseudovirusinfektion in epithelialen Zellen.
- Durch den Gefrier-Tau-Lysevorgang wird das intrazelluläre Luciferase-Enzym effizient freigesetzt.
- Undurchsichtige Platten reduzieren die Hintergrundsignalisierung und verbessern die Signaldetektion während der Lumineszenzmessung.
- Mithilfe des Protokolls lässt sich die neutralisierende Antikörperaktivität durch den Vergleich der Lumineszenzintensitäten bewerten.
Schlussfolgerungen
- Der beschriebene auf Luciferase basierende Assay eignet sich zur Quantifizierung der Pseudovirusinfektion.
- Diese Methode ermöglicht die sichere und genaue Bewertung der Antikörperteutralisation gegen H5-Vogelgrippe.
- Das Protokoll kann für ähnliche virologische und immunologische Untersuchungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Quantitative Luciferase-Reporter-Assays zur Pseudovirusinfektion bieten eine robuste Plattform zur Beurteilung des viralen Eintritts und der neutralisierenden Antikörperaktivität in der frühen antiviralen und Impfstoffforschung. Dieser Ansatz ermöglicht eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung und unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem er reproduzierbare, quantitative Infektionsparameter liefert. Die Methode ist direkt relevant für die Portfoliotriage und die mechanistische Risikominimierung in entdeckungsorientierten, virologisch ausgerichteten Entwicklungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Validierung viraler Eintragswege unter Verwendung sicherer, nicht virulenter Pseudoviren.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Quantifizierung der Infektion in einem kontrollierten, reproduzierbaren System.
- Erleichtert die schnelle Bewertung neutralisierender Antikörperkandidaten hinsichtlich ihrer Zielinteraktion.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert einen standardisierten, quantitativen Endpunkt für das Hochdurchsatz-Screening von antiviralen Wirkstoffen oder Antikörpern.
- Gewährleistet die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit des Assays durch lumineszenzbasierte Detektion.
- Bietet validierte Infektionsparameter, die für nachgeschaltete Screening-Workflows geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht im Einklang mit translationalen Biomarker-Strategien einen quantitativen Vergleich der neutralisierenden Aktivität zwischen Kandidatenmolekülen.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem robuste Infektionsdaten für die Auswahl führender Kandidaten bereitgestellt werden.
- Verringert das biologische Risiko, indem frühzeitige, quantitative Go/No-Go-Entscheidungen ermöglicht werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser auf Luciferase basierende Pseudovirus-Infektionsassay fügt sich in den Kontinuum von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen ein und unterstützt sowohl die Zielvalidierung als auch die Bereitschaft für das Screening im Rahmen von antiviralen Programmen und Impfstoffentwicklungen.
- Entdeckungsbioanalytik: Quantifiziert die Infektion, um Hypothesen über den viralen Eintritt und die Antikörperneutralisation zu testen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Bewertung von Wirkstoffen oder Antikörpern.
- Analytik: Ermöglicht den direkten Vergleich von Infektionsniveaus unter verschiedenen experimentellen Bedingungen anhand von Lumineszenzsignalen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung mit präklinischen Biomarkerstrategien durch quantitative Beurteilung der Neutralisation.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Testplattform, die an verschiedene virale Zielstrukturen und Antikörperkandidaten angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung und der Neutralisierungswirksamkeit.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Quantifizierung der Infektion.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Weiterentwicklung oder Abbruch und reduziert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von antiviralen Wirkstoffen und Impfstoffkandidaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Virologie, Zellkultur und im Betrieb lumineszenzbasierter Assays.
- Benötigt Zugang zu Luminometern und undurchsichtigen 96-Well-Platten für eine genaue Signalerfassung.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung der Infektions- und Lyseprotokolle.
- Kann an verschiedene Pseudovirus-Systeme angepasst werden, sofern eine geeignete Reporter-Gen-Konstruktion vorliegt.
- Hängt von einer sorgfältigen Kontrolle des Hintergrundsignals und der Assay-Bedingungen für eine zuverlässige Quantifizierung ab.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026