Herstellung von Kryoschnitten der Mausretina zur Untersuchung der retinalen Permeabilität für adeno-assoziierte Viren

Nehmen Sie ein Auge von einem Mausmodell mit gestörter retinaler Barriere, das zuvor mit einem adeno-assoziierten Virus, das das Gen für das grün fluoreszierende Protein trägt, präinjiziert wurde.

Die gestörte retinale Barriere ermöglicht es dem AAV, in Photorezeptorzellen einzudringen, wo das virale Genom exprimiert wird und GFP produziert, wodurch die Zellen fluoreszieren.

Präparieren Sie das Auge, um die Hornhaut und die Linse zu entfernen, wobei die Augenschale intakt bleibt.

Das Augenschälchen in eine Fixierlösung eintauchen, um die Retinageometrie zu erhalten.

Überführen Sie die Augenschale nacheinander in konzentriertere kryoprotektive Lösungen. Inkubieren Sie anschließend in der endgültigen Konzentration, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern.

Das Augenschälchen in Kryomedium einbetten und einfrieren.

Unter Verwendung eines Kryostaten schneiden Sie die Augenschale in dünne Schnitte.

Bringen Sie den Schnitt auf einem Objektträger an. Geben Sie einen Puffer mit Detergenzien hinzu, um das Gewebe zu permeabilisieren und den Antikörpern bei der anschließenden Immunfärbung den Zugang zu ermöglichen.

Spülen Sie den Schnitt. Behandeln Sie ihn mit einer Blockierungslösung, um unspe