JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:54 Min. • August 31st, 2026
Nehmen Sie ein Auge von einem Mausmodell mit gestörter retinaler Barriere, das zuvor mit einem adeno-assoziierten Virus, das das Gen für das grün fluoreszierende Protein trägt, präinjiziert wurde.
Die gestörte retinale Barriere ermöglicht es dem AAV, in Photorezeptorzellen einzudringen, wo das virale Genom exprimiert wird und GFP produziert, wodurch die Zellen fluoreszieren.
Präparieren Sie das Auge, um die Hornhaut und die Linse zu entfernen, wobei die Augenschale intakt bleibt.
Das Augenschälchen in eine Fixierlösung eintauchen, um die Retinageometrie zu erhalten.
Überführen Sie die Augenschale nacheinander in konzentriertere kryoprotektive Lösungen. Inkubieren Sie anschließend in der endgültigen Konzentration, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern.
Das Augenschälchen in Kryomedium einbetten und einfrieren.
Unter Verwendung eines Kryostaten schneiden Sie die Augenschale in dünne Schnitte.
Bringen Sie den Schnitt auf einem Objektträger an. Geben Sie einen Puffer mit Detergenzien hinzu, um das Gewebe zu permeabilisieren und den Antikörpern bei der anschließenden Immunfärbung den Zugang zu ermöglichen.
Spülen Sie den Schnitt. Behandeln Sie ihn mit einer Blockierungslösung, um unspezifische Antikörperbindungen während der Immunfärbung zu verhindern.
Der Netzhaut-Cryoschnitt ist bereit für weitere Immunfärbungsverfahren und die Fluoreszenz-Bildgebung. Fluoreszierende GFP-positive Zellen weisen auf eine erfolgreiche virale Transduktion hin und zeigen die Durchlässigkeit der Netzhaut an.
Nach der Entnahme der Augen aus einem euthanasierten, injizierten Tier die Augen sezieren, um Linse und Hornhaut zu entfernen. Anschließend das präparierte Auge zur Fixierung eine Stunde in 4 % Paraformaldehyd einlegen. Nach einer Stunde die Augen zur Kryoschutzbehandlung eine weitere Stunde in 10 %iger Saccharose bei Raumtemperatur geben. Danach die Augen für ein Drittel einer Stunde bei Raumtemperatur in 20 %iger Saccharose einweichen.
Schließlich belassen Sie die Augen über Nacht in einer 30%igen Zuckerslösung bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag werden die Augenschalen in einem Einbettungsharz wie Cryo-Matrix eingebettet und gefroren. Anschließend stellen Sie mit dem Kryostaten 10-Mikrometer-Schnitte her und bringen sie auf für Gefrierschnitte vorbereitete Objektträger auf.
Permeabilisieren Sie nun die Schnitte auf den Objektträgern fünf Minuten lang mit einem Detergens. Anschließend waschen Sie zweimal kurz in PBS. Danach blockieren Sie die Augen eine Stunde lang bei Raumtemperatur.