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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 4:12 Min. • August 31st, 2026
Beginnen Sie mit Hepatozyten, die auf einer mit Kollagen beschichteten Petrischale kultiviert wurden.
Führen Sie einen mit zwei Plasmiden komplexierten Transfektionsreagenz ein: eines trägt ein modifiziertes Hepatitis-B-Virus- oder HBV-Genom, das andere codiert die viralen Strukturproteine.
Inkubieren, um den Eintritt des Plasmids zu ermöglichen. Innerhalb der Zelle werden virale Gene exprimiert, um strukturelle Proteine und ein modifiziertes HBV-Genom zu produzieren, die sich zu rekombinanten HBV-Partikeln zusammenlagern.
Ersetzen Sie das Medium und inkubieren Sie, um die Produktion und Freisetzung viraler Partikel zu unterstützen.
Sammeln Sie das Medium und zentrifugieren Sie es, um die Partikel abzutrennen.
Sammeln Sie das Überstand und filtrieren Sie ihn, um verbleibende Partikel zu entfernen.
Fügen Sie anschließend Polyethylenglykol und Natriumchlorid hinzu, um virale Partikel auszufällen.
Zentrifugieren Sie, um den Inhalt zu pelletieren. Lösen Sie das Pellet in Puffer auf und zentrifugieren Sie das Sediment erneut. Anschließend schichten Sie es auf ein Saccharose-Kissen.
Führen Sie eine Ultrazentrifugation durch, um virale Partikel durch das Polster zu sedimentieren.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Medium.
Filtrieren Sie die Suspension und lagern Sie das gereinigte rekombinante HBV zur weiteren Analyse bei niedriger Temperatur.
Nach der Zubereitung des Zellkulturmediums werden am Tag vor der Transfektion viermal 10 hoch 6 HepG2-Zellen in Medium auf eine 10 cm große, mit Kollagen beschichtete Petrischale gegeben. Die Zellen werden bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator inkubiert. Mit einem Transfektionsreagenz gemäß Herstelleranweisungen werden die Zellen mit 5 µg pUC1.2HBVΔε und 5 µg pUC1.2HBV/NL transfiziert.
Am nächsten Tag das Kulturmedium entfernen und 10 mL frisches Kulturmedium hinzufügen. Eine Woche nach der Transfektion dann das Kulturmedium, das das rekombinante HBV enthält, in einen 50-mL-Probengefäß überführen.
Anschließend sammeln und zentrifugieren Sie das Kulturmedium bei 2.300 × g für fünf Minuten, um den Zelltrümmern, die das rekombinante HBV enthalten, zu entfernen. Leiten Sie das Überstand durch einen 0,45 µm Membranfilter. Geben Sie dann ein äquivalentes Volumen von 25 % PEG, 1,5 molarem NaCl, zum Filtrat und mischen Sie vorsichtig.
Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag zentrifugieren Sie die Lösung bei 2.300 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 0,5 mL TNE-Puffer auf. Anschließend geben Sie 0,5 mL des TNE-Puffers mit rekombinantem HBV auf 0,8 mL 20 % Saccharose in TNE.
Zentrifugieren Sie die beiden Proben 3 Stunden lang bei 100.000 × g und 15 Grad Celsius. Entsorgen Sie so viel wie möglich des Überstandes und verwenden Sie 1 ml serumfreies DMEM pro 40 ml Ausgangskulturmedium, um das Pellet erneut aufzuschwemmen. Inkubieren Sie die Suspension über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Morgen filtrieren Sie die Suspension durch einen 0,45-µm-Filter. Bereiten Sie anschließend Aliquots von jeweils 0,5 ml vor und lagern Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius.