Visualisierung hitzebehandelter viraler Kapside mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Nehmen Sie Röhrchen mit viralen Kapsiden, die virusähnliche Partikel ohne genetisches Material sind.

Erhitzen Sie die Röhrchen bei konstanter Temperatur für unterschiedliche Dauer.

Eine kürzere Heizdauer belastet die Kapsidproteine leicht, während eine verlängerte Erhitzung das Kapsid stört und zur Aggregation führt.

Kühlen Sie die Röhrchen schnell ab, um weitere strukturelle Veränderungen zu verhindern.

Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine Paraffinfolie.

Platzieren Sie ein Gitter für die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) auf den Tropfen. Die Kapside binden an die Oberfläche des Gitters.

Die Überstände mit einem Filterpapier abtupfen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Mit einem Puffer waschen, um locker gebundene Kapside zu entfernen, und das Gitter anschließend erneut abtupfen.

Einmal in Uranylacetat eintauchen, einen Schwermetall-Farbstoff, der an die Capsid-Oberfläche bindet und sie unter dem TEM dunkler erscheinen lässt.

Blottern Sie das Raster und legen Sie es auf eine Platte. Bewahren Sie die Platte in einem Exsikkator auf, um Feuchtigkeit zu entfernen.

Untersuchen Sie das Gitter mit TEM, um hitzeinduzierte Schäden an den Kapsiden sichtbar zu machen.

Führen Sie die Wärmebehandlung wie zuvor durch, ersetzen Sie jedoch 10 Millimolar HEPES, pH 7,4 durch PBS und verdünnen Sie die Kapside nach der Behandlung nicht weiter. Pipettieren Sie anschließend den gesamten 15-Mikroliter-Tropfen der behandelten Kapsidlösung auf die Paraffinfolie. Greifen Sie die Gitterkante mit einer Pinzette, lassen Sie diese an der Kante zusammenschließen, um das Gitter zu halten, und platzieren Sie das Gitter mit der Kohlenstoffseite nach unten auf dem Tropfen der behandelten Lösung.

Lassen Sie das Gitter 10 Minuten lang inkubieren, damit die Kapside an das Gitter binden können. Je nach Reinheit der Kapsidpräparation können Sie Waschschritte mit HEPES-Lösung in Form von 10 bis 15 µL großen Tropfen hinzufügen, die in einer Reihe hinter dem behandelten Kapsidtropfen platziert werden. Nach 10 Minuten heben Sie das Gitter mit dem Tropfen vorsichtig auf.

Platzieren Sie das Gitter nahezu senkrecht zu einem Stück Filterpapier, um den Tropfen abzuziehen. Anschließend nehmen Sie mit dem Gitter den Tropfen von 10 bis 15 µL HEPES-Puffer auf und halten ihn 30 Sekunden lang. Nach 30 Sekunden Waschzeit entfernen Sie die Flüssigkeit erneut mit einem weiteren Stück Filterpapier.

Als Nächstes einen 15 µL-Tropfen einer 2 %igen Uranylacetatlösung auf der Paraffinfolie in einem freien Bereich platzieren. Den Tropfen Uranylacetat mit dem Gitter aufnehmen und 45 Sekunden lang halten. Anschließend das Uranylacetat abgezogen, wobei sichergestellt werden muss, dass der größte Teil der Lösung entfernt wird.

Legen Sie das Gitter mit der Kohlenseite nach oben auf ein Stück Filterpapier, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Gitter nicht an der Feuchtigkeit auf den Pinzetten haften bleibt. Danach stellen Sie das Filterpapier mit dem darauf liegenden Gitter in eine offene Glas-Petri-Schale. Nachdem dieser Vorgang für alle Behandlungen wiederholt wurde, stellen Sie die Petri-Schalenhälften mit den Gittern über Nacht in einen Trockenschrank, um sie vor der Beobachtung mit dem TEM trocknen zu lassen.