Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zelluläre Aufnahme, Sekretion und antiretroviralen Eigenschaften kristalliner antiretroviraler Nanopartikel, die wir als Nano-ART bezeichnen, herzustellen und zu testen. Dies wird erreicht, indem die antiretroviralen Wirkstoffe zunächst durch Ultraschallhomogenisierung oder Nassmahlung verarbeitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die physikalischen Eigenschaften der Nano-ART-Partikel zu charakterisieren, nachdem primäre Monozyten durch Gegenstromzentrifugation isoliert wurden.

Sie werden sieben Tage lang in DMEM kultiviert, das den makrophagenkoloniestimulierenden Faktor (MCSF) enthält, was ihre Differenzierung in aus Monocyten abgeleitete Makrophagen induziert. Der dritte Schritt besteht darin, die Aufnahme, Speicherung und Freisetzung von Nano-ART in humanen aus Monocyten abgeleiteten Makrophagen zu testen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Untersuchung der in-vitro-Antiretroviralen Wirksamkeit von Nano-ART in aus Monocyten abgeleiteten Makrophagen.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die erleichterte Aufnahme und langsame Freisetzung von Nano-Arzneimitteln aus Zellen sowie eine robuste antiretrovirale Wirksamkeit zeigen. Diese werden durch Messungen der Arzneimittelkonzentrationen mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie oder HPLC und durch die Untersuchung infizierter Kulturüberstände mittels Messung der Reverse-Transkriptase-Aktivität bestimmt. Hallo, ich bin Hanta Aldi und Postdoktorandin im Labor von Dr. Howard Gelman am University of Nebraska Medical Center.

Die von uns vorgestellten Methoden können dazu beitragen, zentrale Fragen in der Nanomedizin zu beantworten, beispielsweise wie zellbasierte Arzneimittelabgabesysteme zur Entwicklung translationsorientierter Forschungsaktivitäten genutzt werden können. Dies kann durch den Einsatz nanoformulierter antiretroviraler Therapien mit verlängerter Halbwertszeit erreicht werden. Unsere Studien stützen das potenzielle klinische Anwendungspotenzial von nanoART.

Hallo, mein Name ist Ari Noche und ich bin ein MD-PhD-Student und Stipendiat, der im Carol-Schwartz-Eme­r­ging-Neuroscience-Labor arbeitet. Unter der Anleitung von Dr. Gendelman erweitern sich die Implikationen der hier gezeigten Techniken auf die antiretrovirale Therapie, da nanoformulierte Verbindungen gleichzeitig die Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik verbessern können, während sie gleichzeitig drogenbedingte Nebenwirkungen verringern. Indem wir klinisch verfügbare antiretrovirale Medikamente nehmen und sie in Nanopartikel umformulieren, könnten wir die Therapietreue verbessern und zudem die Krankheitsverläufe positiv beeinflussen.

Hallo, ich bin Dr. Howard Gendelman. Ich bin klinischer Wissenschaftler sowie Professor und Vorsitzender der Abteilung Pharmakologie und Experimentelle Neurowissenschaften am University of Nebraska Medical Center. Unser übergeordnetes Ziel ist es, antiretrovirale Arzneimittel zu vereinfachen, um ihre Verfügbarkeit zu erhöhen und die Biodistribution sowie die Pharmakokinetik zu verbessern.

Jetzt übergebe ich an Ari und Sean, die Sie in das Forschungslabor begleiten und Ihnen zeigen, wie die Herstellung und Entwicklung dieser Nanopartikel erfolgt. Klinische Anwendung und Entwicklung am University of Nebraska Medical Center. Um Nano-Arzneimittel über Nassmahlung herzustellen, wiegen Sie zunächst die Wirkstoffkristalle und die verschiedenen Tenside, die zur Herstellung der Nanoformulierungen verwendet werden, ab und mischen Sie sie mit 10 Millimolar HEPES-Puffer, pH 7,8. Verwenden Sie einen T 18 Ultra-Turrax-Mixer, bis die Mischung vollständig dispergiert ist. Der Wirkstoffanteil in der Formulierung sollte für eine kontinuierliche Mahlung zwischen ein und zwei Prozent liegen.

Stellen Sie sicher, dass die Kältemaschine und der Kompressor eingeschaltet sind und der Ausgangsdruck etwa bei 100 PSI liegt. Richten Sie nun die Vorrichtung so ein, dass das Mahlmedium in den Tank gefüllt werden kann, und geben Sie 50 Milliliter Kugeln in die Mahlkammer. Verwenden Sie dabei einen Trichter und achten Sie darauf, dass sich keine Kugeln in den Gewinden oder außerhalb der Mahlkammer befinden, um Leckagen in der mechanischen Dichtung zu vermeiden. Stellen Sie nun sicher, dass der O-Ring korrekt in seiner Nut an der Mahlkammer sitzt.

Danach eine geeignete Siebmaschenweite auswählen und die Deckel durch Anziehen der Muttern befestigen. Die Siebmaschenweite sollte mindestens halb so groß wie die Perlen sein. Eine große Siebmaschenweite verwenden, um zu verhindern, dass das Produkt bei kontinuierlichem Mahlen den Filter verstopft.

Nachdem die Mahlkammer abgesenkt wurde, die Arzneimittelsuspension mit verschiedenen Mengen an Tensiden zum Produktzulauf hinzufügen. Das Mindestvolumen der Suspension sollte 100 Milliliter betragen. Dies verhindert eine Überhitzung der Mahlkammer und vermeidet zudem eine Verschmutzung durch die Kugeln aufgrund geringeren Verschleißes der Bauteile.

Als Nächstes starten Sie die Pumpe. Mithilfe der Steuereinheit muss die Durchflussrate für Ihre Formulierung variiert werden. Schalten Sie dann den Rührer ein und stellen Sie die Drehzahl an der Steuereinheit ein.

Die Drehzahl kann von 600 Umdrehungen pro Minute auf 4.320 Umdrehungen pro Minute erhöht werden. Überwachen Sie an einem Mikrosur die Temperatur mithilfe des an der Oberseite der Mahlkammer angebrachten Temperaturmessgeräts, um eine Überhitzung auszuschließen. Mahlen Sie nun die Probe bei verschiedenen Drehzahlen und Durchflussraten und entnehmen Sie kleine Aliquote von etwa einem Milliliter der Formulierung zur Bestimmung der Partikelgröße und der Ladung mittels eines Malvern-Zeta-Sizers mit dynamischer Lichtstreuung.

Nach Erreichen der gewünschten Partikelgröße die Mahlung über die Steuereinheit stoppen und bei laufender Pumpe die Probe in einen Kolben sammeln, wobei das Arzneimittel vollständig ablaufen soll. Denken Sie daran, die Pumpe nach Beendigung auszuschalten und die Kugeln zu entfernen und zu reinigen. Überführen Sie nun die Mählsuspension in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie die Zentrifuge auf 10.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten ein.

Nach Beendigung des Zentrifugierzyklus die Menge des Sediments messen und durch die gleiche Menge frische Tensidlösung ersetzen. Sobald die Resuspendierung abgeschlossen ist, die Suspension in die Mahlkammer überführen und 10 Minuten lang mahlen. Einen Aliquot von etwa einem Milliliter entnehmen und erneut Größe und Ladung der Probe mit dem Zeta-Sizer messen.

Schließlich die Konzentration der Nano-Kunst-Formulierungen mittels HBLC messen, um Nano-Kunst durch Homogenisierung herzustellen. Mit dem Avastin Emulex C fünf die Wirkstoffkristalle und verschiedene Tenside wie zuvor beschrieben vorbereiten und die Suspension in das Homogenisiergefäß überführen, anschließend die Rezirkulation starten. Sicherstellen, dass die Kühleinheit eingeschaltet ist, bevor mit der Homogenisierung der Probe begonnen wird.

Erhöhen Sie den Druck schrittweise, bis das Manometer 20.000 ± 2.000 PSI anzeigt, und setzen Sie die Homogenisierung fort, bis die gewünschte Partikelgröße erreicht ist. Dies dauert normalerweise zwischen 45 und 60 Minuten. Entnehmen Sie in regelmäßigen Abständen eine Probe von etwa einem Milliliter und messen Sie Größe und Ladung der Probe mittels eines Zeta-Sizer-Zentrifugenverfahrens, wie zuvor für die homogenisierte Suspension beschrieben.

Danach die Suspension nach der Resus-Suspension in den C5-Homogenisator überführen. Die Zirkulation erneut starten und den Homogenisierungsdruck auf 20.000 ± 2000 PSI einstellen und 30 Minuten lang homogenisieren, um über Sonikation unter Verwendung des kalten Palmer-Ultraschallprozessors herzustellen. Die Chloromethan-PLGA- und Wirkstofflösung in eine 1 %ige PVA-Tensidlösung gießen und im Ultraschallbad in ein Eisbad stellen.

Beginnen Sie die Beschallung mit 50 % Amplitude, wobei die Amplitude für kleinere Probenmengen auf etwa 30 % reduziert werden kann; beschallen Sie die Probe 10 Minuten lang. Entnehmen Sie eine kleine Aliquotprobe zur Partikelgrößenanalyse. Falls die Partikelgröße größer als 1,5 Mikrometer ist, führen Sie die Beschallung in Zwei-Minuten-Intervallen durch, maximal jedoch insgesamt 16 Minuten.

Die Proben unter dem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung beobachten und die Beobachtungen dokumentieren. Mit einem Rührplatte einen ausreichenden Wirbel für die Suspension erzeugen und über Nacht bei Raumtemperatur weitermischen. Die Suspension nach 24 Stunden sammeln und in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gießen.

Zentrifugieren Sie die Proben bei einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei fünf Grad Celsius, dekantieren Sie das Überstand und resuspendieren Sie die eine Hälfte der Probe in 75 Milliliter filtriertem Umkehrosmosewasser und die andere Hälfte in 75 Milliliter 0,5 % CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)-Tensid. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei fünf Grad Celsius und resuspendieren Sie jedes der Pellets in insgesamt 20 Milliliter Mannitollösung. Schließlich messen Sie für Partikel, die entweder durch Homogenisierung oder Sonikation hergestellt wurden, die Partikelgröße mittels Zetasizer und die Konzentration der Proben mittels HPLC.

Um die Probe für die Visualisierung mittels Mikroskopie vorzubereiten, nehmen Sie die hergestellten Suspensionen mit Nano-Kunstwerken und behandeln Sie sie 10 Sekunden lang mit Ultraschall bei 20 % Amplitude unter Verwendung einer Ultraschallsonde. Geben Sie einen Deckglaser auf einen Objektträger und platzieren Sie diesen auf einem inversen Mikroskop. Auf dem Deckglas.

Mischen Sie 15 Mikroliter der Nano-Art-Suspension mit 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und mischen Sie mehrmals durch Auf- und Abpipettieren. Anschließend visualisieren Sie die Nanopartikel mit einem 20-fachen Objektiv, um die Morphologie zu beurteilen. Die Proben können außerdem zur Visualisierung mittels Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet werden.

Hier sehen wir Bilder, die mit einem A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F Niederspannungs-Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop gewonnen wurden, nachdem blutgebundene Monozyten durch Zentrifugation isoliert und gereinigte Monozyten in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in DMEM, ergänzt durch die folgenden Zusatzstoffe, aufgenommen wurden. Anschließend werden 2 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung in 6-Loch-Platten in einer befeuchteten Atmosphäre, angereichert mit 5 % Kohlendioxid, kultiviert und sieben Tage lang inkubiert, um die Differenzierung der Monozyten in Makrophagen zu ermöglichen, um die Zellaufnahme und -ansammlung zu analysieren. Nano Art wird mit Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 100 µM gemischt und jeweils ein Milliliter Behandlungsmedium zu jedem Zeitpunkt oder sobald die Zellen vollständig mit Nano Art beladen sind, zu jeder Vertiefung hinzugefügt.

Entfernen Sie das gesamte Behandlungsmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit je einem Milliliter PBS, um Partikel zu entfernen, die nicht von den Zellen aufgenommen wurden. Lösen Sie die adhärenten Zellen vom Boden der Vertiefung mithilfe eines Zellabhebers und überführen Sie sie in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 1000 RCF und vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 200 Mikroliter 100 % Methanol hinzu, um die Zellen zu lysieren und die Nano-Artefakte durch kurzes Beschallen des Pellets mit einer Schallsonde bei 20 % Amplitude für zwei bis fünf Sekunden aufzulösen. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis die Analyse des Wirkstoffgehalts erfolgen kann. Die intrazelluläre Retention der Nano-Artefakte kann ebenfalls mithilfe der Transmissions-Elektronenmikroskopie visualisiert werden, nachdem Schnitte mit einem Mikrotom präpariert wurden, wie hier dargestellt.

Siehe den begleitenden Text zu diesem Artikel für Einzelheiten zur Analyse der Nano-Arch-Freisetzung; behandeln Sie die Zellen wie zuvor für die Analyse der Zellaufnahme und -sammlung beschrieben. Ersetzen Sie jedoch nach dem Waschen das PBS durch zwei Milliliter Zellkulturmedium ohne MCSF und ohne Nano-Art an den angegebenen Tagen oder jeweils dann, wenn das Medium gelb geworden ist, tauschen Sie an dem gewünschten Tag die Hälfte des Mediums aus. Sammeln Sie ein Milliliter des Zellmediums zusammen mit replizierten Zellen und bearbeiten Sie es zur Arzneimittelanalyse.

Um die Echtzeitaufnahme von Nanoart mit bifokaler Mikroskopie zu visualisieren, nehmen Sie zunächst einen DRE wie beispielsweise Vibrant und geben ihn dem Medium gemäß den Herstelleranweisungen hinzu. Fügen Sie anschließend das farbstoffhaltige Medium zu den ausgereiften, monocytenabgeleiteten Makrophagen hinzu und spülen Sie die Zellen dreimal mit je einem Milliliter Kulturmedium, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Mischen Sie nun Nanoart mit Kulturmedium unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nanoart und geben Sie das Behandlungsmedium mit markierter Nanoart hinzu. Unmittelbar vor der Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop erfassen Sie alle 30 Sekunden ein Bild über einen Zeitraum von vier Stunden hinweg unter Verwendung eines 60-fachen Objektivs.

Schließlich können HIV-1-Infektions- und Infektiositätsassays durchgeführt werden. Behandeln Sie die Zellen zunächst wie zur Visualisierung der Art-Ausschüttung beschrieben. Entfernen Sie dann an den gewünschten Tagen das gesamte Medium und ersetzen Sie es durch Medium ohne M-CSF, das HIV-1A mit einer Multiplizität der Infektion von 0,01 viralen Partikeln pro Zelle enthält, und inkubieren Sie für 24 Stunden.

Entfernen Sie dann das virale Medium und ersetzen Sie es durch frisches Virus. Kultivieren Sie die Zellen 10 Tage lang in Medium ohne Virus, wobei Sie alle zwei Tage oder nach Bedarf die Hälfte des Mediums erneuern, um die Zellen 10 Tage nach der Infektion am Leben zu erhalten. Sammeln Sie 10 Mikroliter Medium aus jedem Wells, geben Sie sie in eine 96-Well-Platte und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis die reverse Transkriptase-Analyse durchgeführt wird. Anschließend können auch HIV-1-p24-Nachweise durchgeführt werden.

Hier können wir die Morphologie von Zellen leicht erkennen, die einem Virus bei einer multiplikativen Infektion von 0,011 Tag nach der Nano-Art-Behandlung ausgesetzt wurden. In diesen monocytenabgeleiteten Makrophagen gibt es keine Anzeichen einer viralen Infektion, und die Nanopartikel sind deutlich im Zellzytoplasma sichtbar. Hier wurden die Zellen 10 Tage nach der Nano-Art-Behandlung dem Virus ausgesetzt.

Einige dieser Zellen waren infiziert, wie durch P24-Färbung und die Bildung mehrkerniger Riesenzellen angezeigt wird, es bestand jedoch weiterhin ein signifikanter Schutz im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Beachten Sie, dass Nanopartikel im Zytoplasma der Zellen in B noch sichtbar sind, jedoch nicht in dem Ausmaß wie in a; diese Strukturen sind in Zellen, die nicht mit Nano Art behandelt wurden, nicht vorhanden. In diesen Live-Cell-Confocal-Videos sehen wir Makrophagen, die grün markiert sind, und Nano Art, das rot markiert ist.

Hier sehen wir, dass die Zellen nur sehr wenige Nanopartikel anreichern. Hier reichern sie die Partikel schnell an, wie durch die zunehmende rote Fluoreszenz angezeigt wird. Diese Unterschiede entsprechen den Befunden, die bei der Analyse der Wirkstoffaufnahme mittels HPLC beobachtet werden. Zusätzlich können wir erkennen, dass die Zellen die Partikel aktiv aufnehmen.

Der Unterschied zwischen den Raten der zellulären Akkumulation von Nano-Kunst reflektiert die Auswirkungen physikalischer Eigenschaften wie Größe, Form und Ladung auf die Fähigkeit von Makrophagen, Nano-Kunst aufzunehmen und zu speichern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nano-Kunst unter Verwendung von Nassmahl-Homogenisierungs- und Ultraschallverfahren herstellt. Dies sind effektive Methoden zur Herstellung von antiretroviralen Nanopartikeln.

Die Nassmahlung und Homogenisierung dienen dazu, größere Arzneimittelkristallpartikel innerhalb von lipiden Tensiden in kleinere Nanopartikel zu fraktionieren, und eine Sonikationstechnik erzeugt einzelne, nanoskalige Arzneimitteltropfen innerhalb eines Polymers. Außerdem haben wir hier gezeigt, wie menschliche, aus Monocyten abgeleitete Makrophagen als Testplattform zur Beurteilung des nanoartigen Transports verwendet werden können. Unsere Testmethode ermöglicht eine sehr einfache Untersuchung der Fähigkeit von Partikeln, von Zellen aufgenommen, gespeichert und freigesetzt zu werden, sowie ihrer Fähigkeit, die Virusreplikation zu hemmen.

Dies ermöglicht es dem Forscher, Nano-Arzneimittel zu identifizieren, die die größte Erfolgschance in vivo und letztendlich bei infizierten Menschen haben könnten. Die vollständigen Ergebnisse dieser Experimente sind in unserem Artikel Online Nano veröffentlicht. Der Artikel trägt den Titel Nano Formulierte Kombinationen von Antiretroviralen Arzneistoffen Verlängern die Arzneimittelfreisetzung und Antiretrovirale Wirkungen in HIV-V1-infizierten Makrophagen, Auswirkungen auf Neuro-AIDS-Therapeutika im Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Vielen Dank.