Name: Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 46 s
Description: Lernen Sie die Herstellung und Charakterisierung von nanoART-Partikeln für die antiretrovirale Therapie mittels Nassmahlung, Homogenisierung und Ultraschall. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Aufnahme, Retention und Freisetzung in humanen Makrophagen.

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Die Arbeit wurde durch Fördermittel 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 und P01 NS43985 (bis HEG) aus der National Institutes of Health unterstützt. Die Autoren danken Frau Robin Taylor für die kritische Durchsicht des Manuskripts und herausragende Grafik-und literarische Unterstützung. Wir möchten Steve Grzelak für seine Nassmahlen Know-how zu danken. Wir möchten auch Dr. Han Chen von der University of Nebraska-Lincoln-Elektronenmikroskopie Core Facility für die Versorgung der Raster-und Transmissions-Elektronenmikroskopie Bilder danken. Schließlich möchten wir Megan Marquart für ihr Know-how mit Live-konfokale Mikroskopie danken.

<ol><li>Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+and+propagation+of+human+immunodeficiency+virus+on+recombinant+colony-stimulating+factor+1-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes.</a> J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+macrophage-based+nanoparticle+platform+for+antiretroviral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery.</a> Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+investigations+for+the+morphologic%2C+pharmacokinetic%2C+and+anti-retroviral+properties+of+indinavir+nanoparticles+in+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 358, 148-158 (2007).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+delivery+of+nanoformulated+antiretroviral+drug+to+the+brain+in+a+murine+model+of+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS.</a> J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulated+Antiretroviral+Drug+Combinations+Extend+Drug+Release+and+Antiretroviral+Responses+in+HIV-1-Infected+Macrophages%3A+Implications+for+NeuroAIDS+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics.</a> J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoART+synthesis%2C+characterization%2C+uptake%2C+release+and+toxicology+for+human+monocyte-macrophage+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed%22%5BJournal%5D)">NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery.</a> Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).</li>
<li>Kalter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HIV+replication+in+macrophage+colony-stimulating+factor-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes.</a> J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).</li>
</ol>

Nanoart sind entworfen, um HIV-1-Therapeutika zu verbessern. Wir haben eine Monozyten-Makrophagen-basierte Drug-Delivery-Systems als ein erster Schritt, um diese Technologien für den klinischen Einsatz zu entwickeln und als Labor-Prüfsystem für nanoformulated Entwicklung von Medikamenten vorgeschlagen. Unsere bisherigen Arbeiten haben gezeigt, dass das System tragfähig für eine solche Anwendung ist 5,6. In dem aktuellen Bericht haben wir Methoden zur Synthese von NP der am häufigsten verwendeten HIV-1 Medikamente (; ritonovir, RTV, Efavirenz, EFV und Atazanavir, ATV Indinavir, IDV) dargestellt. Dies wurde durch Naßvermahlung, Homogenisierung und Ultraschall erreicht. Wichtig ist, ermöglicht es unseren Ansatz für Modifikationen Nanoart physikalischen Eigenschaften wie Größe, Form und Ladung 5,6. Durch die sorgfältige Auswahl von Tensiden, kann man die Ladung des Teilchens von stark negativ auf neutral bis stark positive Kontrolle. Durch die Veränderung der Verarbeitung Zeit und Intensität, kann man die Größe und machen kleine Partikel ≤ 200 nm oder so groß wie ≥ 3 um. Die Form der Teilchen kann auch gesteuert werden, aber in geringerem Maße als die anderen physikalischen Eigenschaften. Zum Beispiel können kugelförmige Partikel via Ultraschall mit Polymeren hergestellt werden, während mehrseitige geometrische Formen über Nassmahlen oder Homogenisierung hergestellt werden können. Nassmahlen und Homogenisierung produzieren unterschiedlich geformte Partikel, aber dieser Prozess ist abhängig von der Fraktionierung Methode und kann nicht direkt für die gesteuert werden. Diese Eigenschaften der Herstellungsmethoden aktivieren können Forschungen auf einfache Weise zu produzieren Nanoart genaue Design-Vorgaben. Das ist unbedingt notwendig, da die physikalisch-chemischen Eigenschaften Nanoart eine starke Wirkung haben beide auf ihre Stabilität und ihre Interaktion mit Zellen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass Nanoart, dass etwa 1 &amp;mgr; m groß sind, haben eine starke positive Ladung, und haben einen vielseitigen geometrischen Form schneller werden von Makrophagen, stabiler einmal im Inneren der Zellen aufgenommen und veröffentlicht über einen längeren Zeitraum Zeit 6. Ein Verfahren zum Testen Nanoart wurde entwickelt, ermöglicht eine einfache Screening der Partikel &#39;Fähigkeit, aufgenommen werden, erhalten und veröffentlicht von Makrophagen, einer der Grundsatz Zielzellen von HIV-1, zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, die virale Replikation zu hemmen. Dies erlaubt es, leicht unterscheiden Nanoart basierend auf Leistung und diejenigen auszuwählen, die beste Chance auf Erfolg in einem In-vivo-Modell, also erhöht die Effizienz und Geschwindigkeit bei der Entwicklung Nanoart für den menschlichen Gebrauch haben. Es hat sich gezeigt, dass Knochenmark der Maus Makrophagen, wenn ex vivo mit Nanoart geladen und adoptiv durch intravenöse Injektion in humanisierter HIV-1 infizierten Mäusen den Stellen der aktiven Infektion reisen können, einschließlich des zentralen Nervensystems, und lassen Sie Medikamente für bis zu 2 Wochen übertragen zu hemmen die virale Replikation 2-4. Darüber hinaus wurden diese Nanoart beladenen Zellen in der Lage, effektiv reduzieren die Anzahl der Virus-infizierten Zellen im Plasma, Lymphknoten, Milz, Leber und Lunge sowie Schutz CD4 + Zellen 2. Diese Studien, obwohl sie vorläufig, zeigen, dass eine Zell-vermittelten Nanoart Abgabesystem kann klinisch signifikante Mengen des Arzneimittels, sowohl Blut und infizierten Geweben verteilen. Aufgrund der ermutigenden vorläufigen Ergebnisse von HIV-1-infizierten Maus-Studien, sind wir derzeit die Entwicklung eines Simian Immuno Deficiency Virus infiziert Makaken-Modell weiter zu testen das Potenzial der Nanoart für den klinischen Einsatz.

Abkürzungen in der Tabelle verwendet: IDV: Indinavir, RTV: Ritonavir, ATV: Atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: Polyvinylalkohol; SDS Natriumdodecylsulfat; P188: Poloxamer 188 (auch als Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: Methyl-poly (Ethylen-Glykol) 1,2-Distearoyl-Phosphatidyl-Ethanolamin; DOTAP: (1-Oleoyl-2-[6 - [(7-Nitro-21 ,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] Hexanoyl] - 3-trimethylammoniumpropanchlorid); PLGA: Poly (Milchsäure-co-Glykolsäure); CTAB: Cetyltrimethylammoniumbromid; DMEM: Dulbecco Modified Eagle Medium; MCSF: Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; HPLC: Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie; HIV-1 : Human Immunodeficiency Virus-1

methodenentwicklung für blood borne makrophagen beförderung von nanoformulated antiretroviralen medikamenten

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated Medikamente verbessern können Pharmakodynamik und Bioverfügbarkeit beim Dienen auch die Medikamente für die antiretrovirale (ART) Medikamente zu reduzieren. Zu diesem Zweck hat unser Labor den Grundsätzen der Nanomedizin angewendet ART zu vereinfachen und als solche zu reduzieren Toxizitäten bei gleichzeitiger Verbesserung der Compliance und Drogen Pharmakokinetik. Einfache und zuverlässige Verfahren zur Herstellung von nanoformulated ART (Nanoart) gezeigt. Partikel aus reinem Wirkstoff durch eine dünne Schicht aus Tensid-Lipid-Schicht gekapselt und produziert durch Fraktionierung größeren Medikamenten-Kristalle in kleinere von beiden Nassmahlen oder Hochdruckhomogenisation. In einem alternativen Verfahren frei Medikament ist in einem Tropfen aus einem Polymer suspendiert. Hierin ist eine medikamentöse innerhalb eines Polymers dann durch Ultraschall gerührt, bis einzelne nanometergroßen Tröpfchen gebildet werden aufgelöst. Die dynamische Lichtstreuung und mikroskopische Untersuchung charakterisieren die physikalischen Eigenschaften der Teilchen (Partikel Größe, Ladung und Form). Ihre biologischen Eigenschaften (Zelle Aufnahme und Retention, Zytotoxizität und antiretrovirale Wirksamkeit) sind mit menschlichen Monozyten-Makrophagen (MDM) bestimmt. MDM sind aus menschlichen Monozyten im peripheren Blut von leukopacks mit Zentrifugalkraft Elutriation zur Reinigung isoliert abgeleitet. Solche Blut übertragbaren Makrophagen als zelluläre Transporter für Nanoart Verteilung an humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten Organen verwendet werden. Wir postulieren, dass das Umpacken von klinisch verfügbaren antiretroviralen Medikamente in Nanopartikel für HIV-1-Behandlungen kann die Einhaltung zu verbessern und positiv beeinflussen Krankheitsverläufe.

Nanopartikel aus Indinavir, Ritonavir, Efavirenz und Atazanavir wurden unter Verwendung Nassmahlen, Homogenisierung und Ultraschall. Diese Nanoformulierungen, kollektiv als nanoformulated antiretroviralen Therapie (Nanoart), beurteilt Makrophagen-based Drug Delivery. Monozyten-Makrophagen-abgeleitete Nanoart Aufnahme, Speicherung und Freisetzung bestimmt. Diese vorläufigen Studien legen nahe, das Potenzial der Nanoart für den klinischen Einsatz.

Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten

Nanoformulierte Medikamente können die Pharmakodynamik und Bioverfügbarkeit verbessern und gleichzeitig dazu beitragen, die Toxizität von antiretroviralen (ART) Arzneimitteln zu reduzieren. Um ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zelluläre Aufnahme, Sekretion und antiretroviralen Eigenschaften kristalliner antiretroviraler Nanopartikel, die wir als Nano-ART bezeichnen, herzustellen und zu testen. Dies wird erreicht, indem die antiretroviralen Wirkstoffe zunächst durch Ultraschallhomogenisierung oder Nassmahlung verarbeitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die physikalischen Eigenschaften der Nano-ART-Partikel zu charakterisieren, nachdem primäre Monozyten durch Gegenstromzentrifugation isoliert wurden.Sie werden sieben Tage lang in DMEM kultiviert, das makrophagenkoloniestimulierenden Faktor (MCSF) enthält, was ihre Differenzierung in monocytenstämmige Makrophagen induziert. Der dritte Schritt besteht darin, die Aufnahme, Speicherung und Freisetzung von Nano-ART in humanen, aus Monocyten abgeleiteten Makrophagen zu testen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Untersuchung der in-vitro-Antiretroviralen Wirksamkeit von Nano-ART in monocytenstämmigen Makrophagen.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die erleichterte Aufnahme und langsame Freisetzung von Nano-Arzneimitteln aus Zellen sowie eine robuste antiretrovirale Wirksamkeit zeigen. Diese werden durch Messungen der Arzneimittelkonzentrationen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC und durch die Untersuchung infizierter Kulturüberstände mittels Messung der Reverse-Transkriptase-Aktivität bestimmt. Hallo, ich bin Hanta Aldi und Postdoktorandin im Labor von Dr. Howard Gelman am Medical Center der University of Nebraska.Die von uns vorgestellten Methoden können dazu beitragen, zentrale Fragen in der Nanomedizin zu beantworten, beispielsweise wie zellbasierte Arzneimittelabgabesysteme zur Entwicklung translationsorientierter Forschungsaktivitäten genutzt werden können. Dies kann durch den Einsatz nanoformulierter antiretroviraler Therapien mit verlängerter Halbwertszeit erreicht werden. Unsere Studien untermauern das potenzielle klinische Anwendungspotenzial von nanoART.Hallo, mein Name ist Ari Noche und ich bin ein MD-PhD-Student-Stipendiat, der im Carol-Schwartz-Emeiding-Neuroscience-Labor arbeitet. Unter der Anleitung von Dr. Gendelman reichen die Implikationen der hier gezeigten Techniken auf die antiretrovirale Therapie aus, da nanoformulierte Verbindungen gleichzeitig die Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik verbessern können, während sie gleichzeitig drogenbedingte Nebenwirkungen reduzieren. Indem wir klinisch verfügbare antiretrovirale Medikamente nehmen und sie in Nanopartikel umverpacken, könnten wir die Therapietreue verbessern und auch die Krankheitsverläufe positiv beeinflussen.Hallo, ich bin Dr. Howard Gendelman. Ich bin klinischer Wissenschaftler sowie Professor und Vorsitzender der Abteilung Pharmakologie und Experimentelle Neurowissenschaften am University of Nebraska Medical Center. Unser übergeordnetes Ziel besteht darin, antiretrovirale Arzneimittel zu vereinfachen, um ihre Verfügbarkeit zu erhöhen und die Biodistribution sowie die Pharmakokinetik zu verbessern.Ich übergebe nun an Ari und Sean, die Sie in das Forschungslabor begleiten und Ihnen zeigen werden, wie die Herstellung und Entwicklung dieser Nanopartikel durchgeführt wird. Klinische Anwendung und Entwicklung am University of Nebraska Medical Center. Um Nano-Artefakte mittels Nassmahlung herzustellen, wiegen Sie zunächst die Wirkstoffkristalle und die verschiedenen Tenside, die zur Herstellung der Nanoformulierungen verwendet werden, ab und mischen Sie diese mit 10 Millimolar-HEPES-Puffer, pH 7,8. Verwenden Sie einen T 18 Ultra-Turax-Mixer, bis die Mischung vollständig dispergiert ist. Der Wirkstoffanteil in der Formulierung sollte für eine kontinuierliche Mahlung zwischen ein und zwei Prozent liegen.Stellen Sie sicher, dass die Kältemaschine und der Kompressor eingeschaltet sind und der Auslassdruck etwa 100 PSI beträgt. Richten Sie nun die Vorrichtung so ein, dass das Mahlmedium in den Tank gefüllt werden kann, und geben Sie 50 Milliliter Kugeln in die Mahlkammer. Verwenden Sie einen Trichter und stellen Sie sicher, dass sich keine Kugeln in den Gewindegängen oder an anderer Stelle außerhalb der Mahlkammer befinden, um Leckagen in der mechanischen Dichtung zu vermeiden. Achten Sie nun darauf, dass die O-Ring-Dichtung an ihrem Platz in der Mahlkammer sitzt.Danach eine geeignete Siebmaschenweite auswählen und die Deckel durch Anziehen der Muttern befestigen. Die Siebmaschenweite sollte mindestens halb so groß wie die Perlen sein. Eine große Siebmaschenweite verwenden, um zu verhindern, dass das Produkt bei der kontinuierlichen Mahlung den Filter verstopft.Nachdem die Mahlkammer abgesenkt wurde, die Arzneimittelsuspension mit verschiedenen Mengen an Tensiden über den Produktzulauf zugeben. Das minimale Volumen der Suspension sollte 100 Milliliter betragen. Dies verhindert eine Überhitzung der Mahlkammer und vermeidet zudem eine Verunreinigung durch die Kugeln, da die Beanspruchung der Bauteile geringer ist.Als Nächstes starten Sie die Pumpe. Mithilfe der Steuereinheit muss die Durchflussrate für Ihre Formulierung variiert werden. Schalten Sie dann den Rührer ein und stellen Sie die Drehzahl an der Steuereinheit ein.Die Drehzahl kann von 600 Umdrehungen pro Minute auf 4.320 Umdrehungen pro Minute erhöht werden. Überwachen Sie an einem Mikrosur die Temperatur mithilfe des an der Oberseite der Mahlkammer angebrachten Temperaturmessgeräts, um eine Überhitzung auszuschließen. Mahlen Sie nun die Probe bei verschiedenen Drehzahlen und Durchflussraten und entnehmen Sie kleine Aliquote von etwa einem Milliliter der Formulierung zur Bestimmung von Größe und Ladung mittels eines Malvern-Zeta-Sizers mit dynamischer Lichtstreuung.Nach Erreichen der gewünschten Größe das Mahlen über die Steuereinheit stoppen und bei laufender Pumpe die Probe in einen Kolben sammeln, wobei das Arzneimittel vollständig ablaufen sollte. Denken Sie daran, die Pumpe nach Beendigung auszuschalten und die Kugeln zu entfernen und zu reinigen. Überführen Sie nun die Mühlsuspension in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie die Zentrifuge auf 10.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten ein.Nach Beendigung des Zentrifugierzyklus die Menge des Überstandes messen und durch die gleiche Menge frische Tensidlösung ersetzen. Sobald die Resuspendierung abgeschlossen ist, die Suspension in die Mahlkammer überführen und 10 Minuten lang mahlen. Einen Aliquot von etwa einem Milliliter entnehmen und erneut Größe und Ladung der Probe mit dem Zeta-Sizer bestimmen.Bestimmen Sie abschließend die Konzentration der Nano-Kunst-Formulierungen mithilfe von HBLC, um Nano-Kunst durch Homogenisierung herzustellen. Bereiten Sie mit dem Avastin Emulex C fünf die Wirkstoffkristalle und verschiedene Tenside wie zuvor beschrieben vor und überführen Sie die Suspension in das Homogenisiergefäß, um die Rezirkulation zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Kältemaschine eingeschaltet ist, bevor Sie mit der Homogenisierung der Probe beginnen.Erhöhen Sie den Druck schrittweise, bis das Manometer 20.000 ± 2.000 PSI anzeigt, und setzen Sie die Homogenisierung fort, bis die gewünschte Partikelgröße erreicht ist. Dies dauert normalerweise zwischen 45 und 60 Minuten. Entnehmen Sie in regelmäßigen Abständen eine Probe von etwa einem Milliliter und messen Sie die Größe und Ladung der Probe mithilfe einer Zeta-Sizer-Zentrifuge, wie zuvor für die homogenisierte Suspension beschrieben.Danach nach der Resus-Suspension die Suspension in den C5-Homogenisator überführen. Die Zirkulation erneut starten und den Homogenisierungsdruck auf 20.000 ± 2000 PSI einstellen und 30 Minuten lang homogenisieren, um über Sonikation unter Verwendung des kalten Palmer-Ultraschallprozessors herzustellen. Die Chloromethan-PLGA- und Wirkstofflösung in eine 1 %ige PVA-Tensidlösung gießen und im Ultraschallbad in ein Eisbad stellen.Beginnen Sie die Beschallung mit 50 % Amplitude, wobei die Amplitude der Beschallung bei kleineren Probemengen auf etwa 30 % reduziert werden kann; beschallen Sie die Probe 10 Minuten lang. Entnehmen Sie eine kleine Aliquotprobe zur Partikelgrößenanalyse. Falls die Partikelgröße größer als 1,5 Mikrometer ist, führen Sie die Beschallung in Zwei-Minuten-Intervallen durch, maximal jedoch insgesamt 16 Minuten.Die Proben unter dem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung beobachten und die Beobachtungen dokumentieren. Mit einem Rührplatte einen ausreichenden Wirbel für die Suspension erzeugen und über Nacht bei Raumtemperatur weitermischen. Die Suspension nach 24 Stunden sammeln und in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gießen.Zentrifugieren Sie die Proben bei einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei fünf Grad Celsius, dekantieren Sie das Überstand und resuspendieren Sie eine Hälfte der Probe in 75 Milliliter filtriertem Reinstwasser und die andere Hälfte in 75 Milliliter 0,5 %igem Cetyltrimethylammoniumbromid-Tensid. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei fünf Grad Celsius und resuspendieren Sie jedes der Pellets mit insgesamt 20 Milliliter Mannitollösung. Messen Sie abschließend für Partikel, die entweder durch Homogenisierung oder Sonikation hergestellt wurden, die Partikelgröße mittels Zetasizer und die Konzentration der Proben mittels HPLC.Zur Vorbereitung der Visualisierung mittels Mikroskopie nehmen Sie die hergestellten Nano-Kunst-Suspensionen und behandeln Sie diese 10 Sekunden lang mit Ultraschall bei 20 % Amplitude unter Verwendung einer Ultraschallsonde. Geben Sie einen Deckglaser auf einen Objektträger und platzieren Sie diesen auf einem inversen Mikroskop. Auf dem Deckglas.Mischen Sie 15 Mikroliter der Nano-Art-Suspension mit 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und mischen Sie mehrmals durch Auf- und Abpipettieren. Anschließend visualisieren Sie die Nanopartikel mit einem 20-fachen Objektiv, um die Morphologie zu beurteilen. Die Proben können außerdem zur Visualisierung mittels Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet werden.Hier sehen wir Bilder, die mit einem A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F Niederspannungs-Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop gewonnen wurden, nachdem blutgebundene Monozyten durch Zentrifugation isoliert und gereinigte Monozyten in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in DMEM, ergänzt durch die folgenden Zusatzstoffe, aufgenommen wurden. Anschließend werden 2 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung in 6-Loch-Platten in einer befeuchteten Atmosphäre, angereichert mit 5 % Kohlendioxid, kultiviert und sieben Tage lang inkubiert, um die Differenzierung der Monozyten in Makrophagen zu ermöglichen, um die Zellaufnahme und -ansammlung zu analysieren. Nano-Art wird mit Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 100 µM vermischt und jeweils ein Milliliter Behandlungsmedium zu jedem Zeitpunkt oder sobald die Zellen vollständig mit Nano-Art beladen sind, zu jeder Vertiefung hinzugefügt.Entfernen Sie das gesamte Behandlungsmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit je einem Milliliter PBS, um Partikel zu entfernen, die nicht von den Zellen aufgenommen wurden. Lösen Sie die adhärenten Zellen vom Boden der Vertiefung mithilfe eines Zellabhebers und überführen Sie sie in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 1000 RCF und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 200 µL 100 % Methanol hinzu, um die Zellen zu lysieren und die Nano-Artefakte durch kurzes Beschallen des Pellets mit einer Schallsonde bei 20 % Amplitude für zwei bis fünf Sekunden aufzulösen. Lagern Sie die Proben bei minus 80 °C, bis die Analyse des Wirkstoffgehalts durchgeführt werden kann. Die intrazelluläre Retention der Nano-Artefakte kann ebenfalls mithilfe der Transmissions-Elektronenmikroskopie visualisiert werden, nachdem Schnitte mit einem Mikrotom präpariert wurden, wie hier dargestellt.Siehe den begleitenden Text zu diesem Artikel für Einzelheiten zur Analyse der Nano-Arch-Freisetzung; behandeln Sie die Zellen wie zuvor für die Analyse der Zellaufnahme und -sammlung beschrieben. Ersetzen Sie jedoch nach dem Waschen das PBS durch zwei Milliliter Zellkulturmedium ohne MCSF und ohne Nano-Art an den angegebenen Tagen oder jeweils dann, wenn das Medium gelb geworden ist, tauschen Sie zur gewünschten Zeit die Hälfte des Mediums aus. Sammeln Sie ein Milliliter des Zellmediums zusammen mit replizierten Zellen und bearbeiten Sie es zur Arzneimittelanalyse.Um die Echtzeitaufnahme von Nanoart mit bifokaler Mikroskopie zu visualisieren, nehmen Sie zunächst einen DRE wie Vibrant und geben ihn gemäß den Herstelleranweisungen dem Medium hinzu. Fügen Sie anschließend das farbstoffhaltige Medium zu den ausgereiften, monocytenabgeleiteten Makrophagen hinzu und spülen Sie die Zellen dreimal mit je einem Milliliter Kulturmedium, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Mischen Sie nun Nanoart mit Kulturmedium unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nanoart und geben Sie das Behandlungsmedium mit markierter Nanoart hinzu. Unmittelbar vor der Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop erfassen Sie alle 30 Sekunden ein Bild über einen Zeitraum von vier Stunden hinweg unter Verwendung eines 60-fachen Objektivs.Schließlich können HIV-1-Infektions- und Infektiositätsassays durchgeführt werden. Behandeln Sie die Zellen zunächst wie zur Visualisierung der Art-Ausschüttung beschrieben. Entfernen Sie dann an den gewünschten Tagen das gesamte Medium und ersetzen Sie es durch Medium ohne M-CSF, das HIV-1A mit einer Multiplizität der Infektion von 0,01 viralen Partikeln pro Zelle enthält, und inkubieren Sie für 24 Stunden.Entfernen Sie dann das virale Medium und ersetzen Sie es durch frisches Virus, kultivieren Sie die Zellen 10 Tage lang in Medium ohne Virus, wobei Sie alle zwei Tage oder nach Bedarf die Hälfte des Mediums erneuern, um die Zellen 10 Tage nach der Infektion am Leben zu erhalten. Sammeln Sie 10 Mikroliter Medium aus jedem Wells, geben Sie sie in eine 96-Well-Platte und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis die reverse Transkriptase-Analyse durchgeführt wird. Anschließende HIV-1-p24-Nachweise können ebenfalls durchgeführt werden.Hier können wir die Morphologie von Zellen leicht erkennen, die einem Virus bei einer multiplikativen Infektion von 0,011 Tag nach der Nano-Art-Behandlung ausgesetzt wurden. In diesen monocytenabstammenden Makrophagen gibt es keine Anzeichen einer viralen Infektion, und die Nanopartikel sind deutlich im Zellzytoplasma sichtbar. Hier wurden die Zellen 10 Tage nach der Nano-Art-Behandlung dem Virus ausgesetzt.Einige dieser Zellen waren infiziert, wie durch P24-Färbung und die Bildung mehrkerniger Riesenzellen angezeigt wird, doch gab es im Vergleich zu unbehandelten Zellen immer noch einen signifikanten Schutz. Beachten Sie, dass Nanopartikel im Zytoplasma der Zellen in B weiterhin sichtbar sind, jedoch nicht in dem Ausmaß wie in a; diese Strukturen sind in Zellen, die nicht mit Nano Art behandelt wurden, nicht vorhanden. In diesen Live-Cell-Konfokalvideos sehen wir Makrophagen, die grün markiert sind, und Nano Art, das rot markiert ist.Hier sehen wir, dass die Zellen nur sehr wenige Nanopartikel anreichern. Hier hingegen reichern sie Partikel rasch an, wie durch zunehmende rote Fluoreszenz angezeigt. Diese Unterschiede entsprechen den Befunden, die bei der Analyse der Arzneimittelaufnahme mittels HPLC beobachtet werden. Zusätzlich können wir erkennen, dass die Zellen die Partikel aktiv aufnehmen.Der Unterschied zwischen den Raten der zellulären Akkumulation von Nano-Kunst spiegelt die Auswirkungen physikalischer Eigenschaften wie Größe, Form und Ladung auf die Fähigkeit von Makrophagen wider, Nano-Kunst aufzunehmen und zu speichern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nano-Kunst mithilfe von Nassmahlhomogenisierung und Ultraschallbehandlung herstellt. Dies sind wirksame Methoden zur Herstellung von antiretroviralen Nanopartikeln.Die Nassmahlung und Homogenisierung dienen dazu, größere Arzneimittelkristallpartikel innerhalb von lipiden Tensiden in kleinere Nanopartikel zu fraktionieren, und eine Sonikationstechnik erzeugt einzelne, nanoskalige Arzneimitteltropfen innerhalb eines Polymers. Außerdem haben wir hier gezeigt, wie menschliche, aus Monocyten abgeleitete Makrophagen als Testplattform zur Beurteilung des Transports von Nano-Arzneimitteln verwendet werden können. Unsere Testmethode ermöglicht eine sehr einfache Untersuchung der Fähigkeit von Partikeln, von Zellen aufgenommen, gespeichert und freigesetzt zu werden, sowie ihrer Fähigkeit, die Virusreplikation zu hemmen.Dies ermöglicht es dem Forscher, Nano-Arzneimittel zu identifizieren, die die besten Erfolgschancen in vivo und letztendlich bei infizierten Menschen haben könnten. Die vollständigen Ergebnisse dieser Experimente sind in unserem Artikel Online Nano veröffentlicht. Der Artikel trägt den Titel Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics in der Zeitschrift Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.Vielen Dank.

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Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen

In dieser Studie wurden In-silico-Strategien verwendet, um das aufgezählte Etravirin als vielversprechendes Therapeutikum für HIV zu identifizieren. Unsere Erkenntnisse über molekulare Wechselwirkungen und Dynamiken unterstützen das rationale Design neuartiger NNRTIs als mögliche HIV-Behandlungsalternativen.

Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung, Aktivitätsvorhersage und Molekulardynamik von Nicht-Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren

Lernen Sie die Herstellung und Charakterisierung von nanoART-Partikeln für die antiretrovirale Therapie mittels Nassmahlung, Homogenisierung und Ultraschall. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Aufnahme, Retention und Freisetzung in humanen Makrophagen.

Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten

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