Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten

Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Aufnahme, Sekretion und antiretrovirale Eigenschaften von kristallinen antiretroviralen Nanopartikeln herzustellen und zu testen, die wir als Nanokunst bezeichnen. Dies wird erreicht, indem die antiretroviralen Medikamente zunächst durch Beschallung, Homogenisierung oder Nassmahlen verarbeitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die physikalischen Eigenschaften der Nano-Art-Partikel zu charakterisieren, nachdem primäre Monozyten durch Gegenstromzentrifugation isoliert wurden.

Sie werden sieben Tage lang in DMEM kultiviert, das den Makrophage Colony Stimulating Factor (MCSF) enthält, der ihre Differenzierung in von Monozyten abgeleitete Makrophagen induziert. Der dritte Schritt besteht darin, die Aufnahme, Retention und Freisetzung von Nanokunst in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen zu testen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die in vitro antiretrovirale Wirksamkeit von Nano ART an Monozyten-abgeleiteten Makrophagen zu testen.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die erleichterte Aufnahme und langsame Freisetzung von Nano-ART aus den Zellen und eine robuste antiretrovirale Wirksamkeit zeigen. Diese werden durch Messungen des Wirkstoffspiegels, durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC und durch Testen infizierter Kultursupinatmaterialien durch Messung der Reverse-Transkriptase-Aktivität bestimmt. Hallo, ich bin Hanta Aldi und ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Howard Gelman am University of Nebraska Medical Center.

Die von uns vorgestellten Methoden können dazu beitragen, zentrale Fragen der Nanomedizin zu beantworten, darunter die Frage, wie zellbasierte Wirkstoffverabreichungssysteme für die Entwicklung translationaler Forschungsaktivitäten genutzt werden können. Dies kann durch die Anwendung einer nanoformulierten antiretroviralen Therapie mit verlängerten Halbfrauen erreicht werden. Unsere Studien unterstützen den potenziellen Einsatz von Nano-Kunst für den klinischen Einsatz.

Hallo, mein Name ist Ari Noche und ich bin ein MD-Doktorand und arbeite im Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratory. Unter der Leitung von Dr. Gendelman erstrecken sich die Implikationen der Techniken, die wir Ihnen hier zeigen, auf die antiretrovirale Therapie, da nanoformulierte Verbindungen gleichzeitig die Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik verbessern und gleichzeitig arzneimittelbedingte Nebenwirkungen reduzieren können. Durch die Einnahme klinisch verfügbarer antiretroviraler Medikamente und deren Umverpackung in Nanopartikel können wir möglicherweise die Compliance verbessern und auch den Krankheitsverlauf positiv beeinflussen.

Hallo, ich bin Dr. Howard Gendelman. Ich bin klinischer Wissenschaftler und Professor und Vorsitzender der Abteilung für Pharmakologie und experimentelle Neurowissenschaften hier am University of Nebraska Medical Center. Unser Ziel ist es, antiretrovirale Medikamente zu vereinfachen, um sie leicht verfügbar zu machen und die Biodistribution und Pharmakokinetik zu verbessern.

Nun übergebe ich an Ari und Sean, die euch in das Forschungslabor bringen und euch zeigen, wie die Herstellung und Entwicklung dieser Nanopartikel erfolgt. Klinischer Nutzen und Entwicklung hier am University of Nebraska Medical Center Herstellung von Nanokunst durch Nassfräsen. Wiegen Sie zuerst die Arzneimittelkristalle und verschiedene Tenside, die zur Herstellung der Nanoformulierungen verwendet werden, und mischen Sie sie mit 10 millimolaren Heis-Puffer pH 7,8 Mit einem T 18 ultra Turx-Mischer sollte der Prozentsatz des Arzneimittels in der Formulierung zwischen einem und 2 % liegen, bis er vollständig dispergiert ist.

Stellen Sie sicher, dass der Kühler und der Kompressor eingeschaltet sind und dass der Prognosedruck jetzt bei etwa 100 PSI liegt, damit die Mahlkörper in den Tank geladen und 50 Milliliter Perlen in die Mahlkammer gegeben werden können. Stellen Sie mit einem Trichter sicher, dass sich keine Perlen in den Gewinden oder irgendwo außerhalb der Mahlkammer befinden, um Undichtigkeiten in der Gleitringdichtung zu vermeiden. Stellen Sie nun sicher, dass der O-Ring an seinem Platz in der Mahlkammer sitzt.

Wählen Sie dann eine geeignete Siebmaschenweite und sichern Sie die Deckel durch Anziehen der Muttern. Die Maschenweite des Siebs sollte mindestens halb so groß sein wie die Perlen. Verwenden Sie eine große Siebmaschenweite, um zu vermeiden, dass das Produkt den Filter während des kontinuierlichen Mahlens verstopft.

Nach dem Absenken der Mahlkammer die Wirkstoffsuspension mit unterschiedlichen Mengen an Tensiden in den Produkteinlauf geben. Das Mindestvolumen der Suspension sollte 100 Milliliter betragen. Dadurch wird eine Überhitzung der Mahlkammer verhindert und eine Verschmutzung der Raupe durch geringeren Verschleiß der Teile vermieden.

Starten Sie anschließend die Pumpe. Mit der Steuerung ist eine Variation der Durchflussmenge für Ihre Formulierung erforderlich. Schalten Sie dann das Rührwerk ein und stellen Sie die Drehzahl an der Steuereinheit ein.

Die Geschwindigkeit kann von 600 Umdrehungen pro Minute auf 4.320 Umdrehungen pro Minute erhöht werden. Überwachen Sie auf einem Micro Sur die Temperatur mit dem Temperaturmessgerät, das oben an der Mahlkammer angebracht ist, um sicherzustellen, dass es nicht zu einer Überhitzung kommt. Mahlen Sie nun die Probe bei verschiedenen Geschwindigkeiten und Durchflussraten und entnehmen Sie kleine Aliquots von etwa einem Milliliter der Formulierung für Größen- und Ladungsmessungen mit einem beugungslichtstreuenden Malvern-Zeta-Sizer.

Nachdem die gewünschte Größe erreicht wurde, stoppen Sie das Mahlen mit der Steuereinheit und sammeln Sie die Probe bei eingeschalteter Pumpe in einen Kolben, damit das Arzneimittel vollständig abfließen kann. Denken Sie daran, die Pumpe auszuschalten, wenn Sie fertig sind, und die Perlen zu entfernen und zu reinigen. Füllen Sie nun die Mühlensuspension in 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen um und stellen Sie die Zentrifuge 30 Minuten lang auf 10.000 Umdrehungen pro Minute ein.

Nach Beendigung des Zentrifugenzyklus die Satmenge abmessen und durch die gleiche Menge frischer Tensidlösung ersetzen. Sobald die Resus-Suspension fertig ist, geben Sie die Suspension in die Mahlkammer und mahlen Sie sie 10 Minuten lang. Nehmen Sie ein Aliquot von etwa einem Milliliter und messen Sie die Größe und Ladung der Probe erneut mit dem Zeta-Sizer.

Messen Sie schließlich die Konzentration der Nanokunst-Formulierungen mit HBLC, um Nanokunstformulierungen durch Homogenisierung herzustellen. Bereiten Sie mit dem Avastin Emulex C five die Arzneimittelkristalle und verschiedene Tenside wie zuvor beschrieben vor, überführen Sie die Suspension in das Homogenisierungsgefäß und beginnen Sie mit der Rezirkulation. Stellen Sie sicher, dass der Kühler eingeschaltet ist, bevor Sie mit der Homogenisierung der Probe beginnen.

Erhöhen Sie den Druck schrittweise, bis das Messgerät 20.000 plus oder minus 2000 PSI anzeigt, und setzen Sie die Homogenisierung fort, bis die gewünschte Partikelgröße erreicht ist. Dies dauert in der Regel zwischen 45 und 60 Minuten. Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen ein Eloqua von etwa einem Milliliter und messen Sie die Größe und Ladung der Probe mit einer Zetasizer-Zentrifuge, der homogenisierten Suspension, wie zuvor beschrieben.

Nach der Resus-Suspension wird die Suspension in den C-Fünf-Homogenisator überführt. Starten Sie die Zirkulation neu und stellen Sie den Homogenisierungsdruck auf 20.000 plus oder minus 2000 PSI wieder her und homogenisieren Sie 30 Minuten lang, um sie durch Beschallung mit dem kalten Palmer-Ultraschallprozessor herzustellen. Gießen Sie das Chlormethan, PLGA und die Arzneimittellösung in eine 1%ige PVA-Tensidlösung und legen Sie sie in ein Eisbad im Ultraschall.

Beginnen Sie die Beschallung bei 50 % Amplitude, obwohl die Amplitude des Beschallungsmittels bei kleineren Probenchargen auf etwa 30 % Amplitude reduziert werden kann, beschallen Sie die Probe 10 Minuten lang. Entnehmen Sie ein kleines Aliquot für die Partikelgrößenanalyse. Wenn die Größe der Partikel größer als 1,5 Mikrometer ist, beschallen Sie die Proben in Abständen von zwei Minuten bis zu einem Maximum von insgesamt 16 Minuten.

Betrachten Sie die Proben unter dem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung und dokumentieren Sie die Beobachtungen. Verwenden Sie eine Rührplatte, um einen ausreichenden Wirbel für die Suspension zu erzeugen, und mischen Sie über Nacht bei Raumtemperatur weiter. Die Suspension nach 24 Stunden auffangen und in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen füllen.

Zentrifugieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute, dekantieren Sie das Supinat und resuspendieren Sie eine Hälfte der Probe in 75 Millilitern gefiltertem Reversosmosewasser und die andere Hälfte in 75 Millilitern 0,5 % Ctal-Trimethylammoniumbromid-Tensid. Zentrifugieren Sie die Proben erneut mit einer Geschwindigkeit von 8.000 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei fünf Grad Celsius und resuspendieren Sie jedes der Pellets mit insgesamt 20 Millilitern Mannitollösung. Bei Partikeln, die entweder durch Homogenisierung oder Beschallung hergestellt werden, messen Sie schließlich die Größe der Partikel mit dem Zeta-Messgerät und messen Sie die Konzentration der Proben mit HPLC.

Um sich auf die Visualisierung mit Mikroskopie vorzubereiten, nehmen Sie die vorbereiteten Nano-Art-Suspensionen und beschallen Sie sie 10 Sekunden lang. Bei einer Amplitude von 20 % mit einer Ultraschallsonde nehmen Sie einen Objektträger-Abdeckschirm und legen Sie ihn auf ein inverses Mikroskop. Auf dem Deckglas.

Mischen Sie 15 Mikroliter der nano art Suspension mit 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Visualisieren Sie dann die Nanopartikel mit einem 20-fachen Objektiv, um die Morphologie zu visualisieren. Auch mit der Rasterelektronenmikroskopie können Proben für die Visualisierung vorbereitet werden.

Hier sehen wir Bilder, die von einem A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F Niederspannungs-Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop nach Isolierung von durch Blut getragenen Monozyten durch Zentrifugation an gereinigten Monozyten in einer Konzentration von eins mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter zu DMEM erhalten wurden, ergänzt mit den folgenden Additiven. Dann die sechs Zellen pro Vertiefung in sechs Vertiefungsplatten in einer befeuchteten Atmosphäre, ergänzt mit 5 % Kohlendioxid und einer Kultur für sieben Tage, damit sich die Monozyten in Makrophagen differenzieren können, um die Zellaufnahme und -sammlung zu analysieren. Mischen Sie Nano-Kunst mit Nährmedien bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikromolaren und geben Sie jeweils einen Milliliter Behandlungsmedium zum gewünschten Zeitpunkt oder wenn die Zellen vollständig mit Nano-Kunst beladen sind.

Entfernen Sie das gesamte Behandlungsmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter PBS, um alle Partikel zu entfernen, die nicht von den Zellen in einem Milliliter PBS aufgenommen wurden. Entfernen Sie die Adhärenzzellen mit einem Zellheber vom Boden der Vertiefung und geben Sie sie in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Nun zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 RCF bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Entfernen Sie das Supinat und fügen Sie 200 Mikroliter 100%Methanol hinzu, die Zellen liegen und lösen Sie Nanokunst auf, indem Sie das Pellet mit einer Schallsonde bei 20%Amplitude für zwei bis fünf Sekunden kurz schallen. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Analyse des Arzneimittelgehalts bereit sind. Die intrazelluläre Retention von Nanokunst kann auch mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden, nachdem Schnitte mit einem Mikrotom vorbereitet wurden, wie hier zu sehen.

Im Begleittext zu diesem Artikel finden Sie Details zur Analyse von Nano-Arch-Release-Treatment-Zellen, wie zuvor für die Analyse der Zellaufnahme und -entnahme beschrieben. Anstatt jedoch Zellen nach dem Waschen zu sammeln, ersetzen Sie PBS durch zwei Milliliter Zellkulturmedium ohne MCSF und ohne Nanokunst an den angegebenen Tagen oder, wie durch das gelb färbende Medium angezeigt, tauschen Sie die Hälfte des Mediums am gewünschten Tag aus. Sammeln Sie einen Milliliter des Zellmediums zusammen mit den replizierten Zellen und verarbeiten Sie es für die Arzneimittelanalyse.

Um die Echtzeitaufnahme der bifokalen Nano-Art-Mikroskopie zu visualisieren, nehmen Sie zuerst ein DRE wie Vibrant und fügen Sie es dem Medium hinzu. Gemäß den Anweisungen des Herstellers fügen Sie das farbstoffhaltige Medium zu den reifen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen hinzu und spülen Sie dann die Zellen dreimal mit einem Milliliter Kulturmedium aus, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Mischen Sie nun Nano-Kunst mit Nährmedium unter Verwendung von fluoreszenzmarkierter Nano-Kunst und fügen Sie Behandlungsmedium mit markierter Nano-Kunst hinzu. Unmittelbar vor der Bildgebung mit einem Konfokalmikroskop nehmen Sie vier Stunden lang alle 30 Sekunden ein Bild mit einem 60-fach-Objektiv auf.

Schließlich können HIV-1-Infektions- und Infektiositätstests durchgeführt werden. Behandeln Sie zunächst die Zellen wie beschrieben zur Visualisierung der Kunstfreisetzung. Entfernen Sie dann an den gewünschten Tagen das gesamte Medium und ersetzen Sie es durch ein Medium ohne MCSF, das HIV eins a A bei einer Vielzahl von Infektionen von 0,01 Viruspartikeln pro Zelle enthält, und inkubieren Sie es 24 Stunden lang.

Entfernen Sie dann das Virusmedium und ersetzen Sie es 10 Tage lang durch frische Viruskulturzellen, wobei die Hälfte des Mediums jeden zweiten Tag oder nach Bedarf ausgetauscht wird, um die Zellen 10 Tage nach der Infektion am Leben zu erhalten. Sammeln Sie 10 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung, geben Sie sie in eine 96-Well-Platte und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Durchführung der reversen Transkriptase-Analyse bereit sind. Nachfolgende HIV one P 24-Nachweise können ebenfalls durchgeführt werden.

Hier können wir leicht die Morphologie von Zellen sehen, die bei einer multiplikativen Infektion von 0,011 Tagen nach der Nano-Art-Behandlung dem Virus ausgesetzt waren. In diesen von Monozyten abgeleiteten Makrophagen gibt es keine Hinweise auf eine Virusinfektion und die Nanopartikel sind im Zytoplasma der Zelle gut sichtbar. Hier wurden die Zellen 10 Tage nach der Nano-Art-Behandlung dem Virus ausgesetzt.

Einige dieser Zellen waren infiziert, wie die P24-Färbung und die Bildung mehrkerniger Riesenzellen zeigten, aber es gab immer noch einen signifikanten Schutz im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Beachten Sie, dass Nanopartikel immer noch im Zytoplasma von Zellen in B sichtbar sind, aber nicht so viel wie in a, diese Strukturen sind in Zellen, die nicht mit Nanokunst behandelt wurden, nicht vorhanden. In diesen konfokalen Videos mit lebenden Zellen sehen wir Makrophagen, die grün markiert sind, und Nano-Art, die rot markiert sind.

Hier sehen wir, dass die Zellen nur sehr wenige Nanopartikel ansammeln. Hier lagern sie schnell Partikel an, was sich durch eine erhöhte rote Fluoreszenz anzeigt. Diese Unterschiede decken sich mit den Ergebnissen, die bei der Analyse der Medikamentenaufnahme mit Hilfe der HPLC zu sehen sind, wie die Zellen die Partikel aktiv aufnehmen.

Die Differenz zwischen den Akkumulationsraten zellulärer Nanokunst spiegelt die Auswirkungen physikalischer Eigenschaften wie Größe, Form und Ladung auf die Fähigkeit von Makrophagen wider, Nanokunst aufzunehmen und zu behalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nanokunst mit Hilfe von Nassmahl-, Homogenisierungs- und Beschallungstechniken herstellt. Dies sind effektive Methoden zur Herstellung von antiretroviralen Nanopartikeln.

Das Nassmahlen und die Homogenisierung dienen dazu, größere Wirkstoffkristallpartikel in Lipidtensiden in kleinere Nanopartikel zu fraktionieren, und eine Ultraschalltechnik erzeugt einzelne Wirkstofftröpfchen in Nanogröße innerhalb eines Polymers. Hier haben wir auch gezeigt, wie man von menschlichen Monozyten abgeleitete Makrophagen als Testplattform zur Bewertung des Nano-Art-Transports verwenden kann. Unsere Testmethode ermöglicht ein sehr einfaches Screening der Fähigkeit eines Partikels, von Zellen aufgenommen, zurückgehalten und freigesetzt zu werden, sowie seiner Fähigkeit, die Virusreplikation zu hemmen.

Dies ermöglicht es dem Forscher, Nanokunst zu identifizieren, die die besten Aussichten hat, in vivo und schließlich für den Einsatz bei infizierten Menschen erfolgreich zu sein. Die vollständigen Ergebnisse dieser Experimente finden Sie in unserem Artikel Online Nano. Der Artikel trägt den Titel Nano Formulation Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics im Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Vielen Dank.