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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:30 Min. • August 31st, 2026
Beginnen Sie mit teilweise dissoziierten murinen Dünndarm-Organoiden, um die lentivirale Transduktion zu erleichtern.
Nehmen Sie die lentiviralen Vektoren in einem Transduktionsmedium.
Das Lentivirus trägt ein Gen der Interesse für die stabile Integration in das Wirtsgenom.
Fügen Sie das Lentivirus dem Gewebekulturbrüfling hinzu.
Die Mischung inkubieren, um den viralen Eintritt zu ermöglichen.
Die virale RNA wird in DNA umgeschrieben und integriert sich in das Wirtsgenom ein.
Fügen Sie ein Organoid-Medium hinzu und überführen Sie die Mischung in ein Reagenzglas.
Zentrifugieren, um nicht gebundene Viren zu entfernen.
Mischen Sie das Pellet in einer Basalmembranmatrix.
Stellen Sie die Organoide in eine Vertiefung und lassen Sie sie erstarren.
Die Matrix bildet ein Netzwerk, das Organoiden einschließt und strukturelle Unterstützung bietet.
Fügen Sie Organoid-Medium, ergänzt mit Wachstumsförderern, hinzu, um die Proliferation der Organoiden zu unterstützen.
Dies führt zu knospenden Organoiden, die das transduzierte Gen enthalten und für weitere funktionelle Analysen verwendet werden können.
Überführen Sie die Organoiden in dieser letzten kleinen Menge Medium in eine Vertiefung einer 48-Loch-Platte.
Fügen Sie das zuvor hergestellte Lentivirus mit hoher Titerkonzentration in Transduktionsmedium zu den Organoiden hinzu und resuspendieren Sie. Inkubieren Sie die Organoid-Virus-Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Kulturinkubator, um die Transduktion zu ermöglichen. Geben Sie nach einer Stunde ein Milliliter Organoid-Kulturmedium zur Organoid-Virus-Mischung, resuspendieren Sie erneut und überführen Sie die Mischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 850 × g.
Um die Organoiden zu pelletieren, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 µL eiskaltem Matrigel. Geben Sie den Tropfen in die Mitte einer Vertiefung. In einer 48-Loch-Platte 15 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, damit der Tropfen erstarrt. Nach 15 Minuten vorsichtig 250 µL Organoiden-Kulturmedium, ergänzt mit Nicotinamid und Kinasemhemmstoffen, hinzufügen.