JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:40 Min. • August 31st, 2026
Nehmen Sie Kulturen von Brustkrebszellen.
Simultaninfektion mit zwei Arten von Adenoviren. Eines trägt ein Gen für das grün fluoreszierende Protein oder GFP unter einem konstitutiv aktiven Promotor.
Der andere enthält ein Reportergen, das für das rote fluoreszierende Protein oder RFP kodiert, unter einem SMAD-antwortfähigen Promotor.
Zu der Testkultur TGF-Beta hinzufügen und inkubieren.
Die Viren binden an den Rezeptor, um in die Wirtszelle einzudringen, übertragen die Gene in den Zellkern und ermöglichen die Expression von GFP.
In Testzellen bindet TGF-Beta an seinen Rezeptor und aktiviert den SMAD-Signalweg durch Phosphorylierung der Proteine SMAD2 und SMAD3.
Diese Proteine bilden einen Komplex mit SMAD4.
Dieser Komplex bindet an den Promotor des Reportergens, wodurch zusätzlich zu GFP auch die Expression von RFP ermöglicht wird.
Im Kontrollversuch bleibt der SMAD-Signalweg inaktiv, sodass die Zellen nur GFP exprimieren.
Nehmen Sie fluoreszierende Bilder von lebenden Zellen auf.
Das Vorhandensein beider Signale bestätigt die Aktivierung des SMAD-Signalwegs mittels dualer Adenovirus-Transduktion.
Am Tag der Adenovirus-Infektion werden die Vertiefungen einer 12-Loch-Platte mit jeweils etwa 1,25 × 10⁵ MDA-MB-231-Zellen in 500 μL Medium bei einer Konfluenz von 35 % beimpft. Alle Vertiefungen werden mit 75 μL Adenovirus-CMV-GFP und 7,5 μL Adenovirus-CAGA12-Td-Tomato infiziert, um eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 2.500 zu erreichen, die eine Infektionsrate von 100 % ermöglicht. Anschließend wird TGF-beta unmittelbar nach der Adenovirus-Infektion der Behandlungsgruppe hinzugefügt.
Bei 37 Grad Celsius mit 10 % Kohlendioxid 24 Stunden inkubieren. Am nächsten Tag lebende Zellen mit einem Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskop abbilden.