Multiplexes Fluoreszenz-Imaging von viralen Nukleinsäuren und Proteinen in infizierten menschlichen Lymphozyten

Beginnen Sie mit humanen Lymphozyten, die mit HIV-1 infiziert sind und auf einem Deckglas auf einem Objektträger montiert sind.

Diese Zellen wurden mit Sonden hybridisiert, die virale RNA und provirale DNA fluoreszenzmarkieren.

Die Zellen in einer Blockierungslösung inkubieren, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Fügen Sie primäre Antikörper ein, die gegen das HIV-1-Kapsidprotein gerichtet sind.

Inkubieren Sie, um den Bindungsprozess der primären Antikörper an das Kapsidprotein zu ermöglichen.

Waschen Sie die Zellen mit Puffer, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörper hinzu, die an die primären Antikörper binden.

Die nicht gebundenen Antikörper abwaschen.

Fügen Sie einen DNA-spezifischen Farbstoff hinzu, um die Kerne der Zellen anzufärben, und waschen Sie anschließend überschüssigen Farbstoff weg.

Verwenden Sie die multiplexe Fluoreszenzbildgebung, um virale DNA, RNA, Proteine und Wirtszellkerne gleichzeitig in unterschiedlichen Farben nachzuweisen.

Diese Einzelzellvisualisierung ermöglicht die Untersuchung verschiedener Stadien des viralen Lebenszyklus durch die gleichzeitige Visualisierung von viraler DNA, RNA und Proteinen in infizierten Zellen.

Für die Immunfärbung der Proteine von Interesse nach der letzten Waschung jede Deckplatte mit 200 µL Blockierpuffer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur behandeln.

Am Ende der Inkubation das Blockierpuffer abgießen und 200 µL des in PBS mit Tween 20 ergänzt durch 1 % Rinderserumalbumin verdünnten Primärantikörpers hinzufügen. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur die Objektträger zweimal je 10 Minuten mit frischem PBS mit Tween 20 unter Schütteln waschen, bevor die Proben mit einem geeigneten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur markiert werden. Am Ende der Inkubation die Objektträger zwei Mal je 10 Minuten mit frischem PBS mit Tween 20 unter Schütteln waschen.

Nach der zweiten Waschung die Kerne mit einem geeigneten Kernfarbstoff für eine Minute bei Raumtemperatur kontrastfärben, gefolgt von zwei Waschungen in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln.