Reinigung von Prototype-Foamy-Virus-Intasomen mittels Größenausschlusschromatographie

Beginnen Sie mit einer Suspension, die Präzipitate von Prototyp-Foamyvirus- oder PFV-Intasomen, monomeren Integrases, DNA-Oligomeren und Proteinaggregaten enthält.

PFV-Intasomen sind Tetramere viraler Integrassen, die mit synthetischen Oligomeren komplexiert sind und virale genomische DNA mimikrieren.

Fügen Sie eine Salzlösung zur Suspension hinzu und inkubieren Sie sie auf Eis. Das Salz verringert die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Intasomen, wodurch die Präzipitate löslich werden.

Pipettieren Sie in regelmäßigen Abständen vorsichtig, um die Solubilisierung des Intasoms zu fördern.

Zentrifugieren Sie, um das verbleibende Präzipitat zu pelletieren, und sammeln Sie den Überstand, der lösliche Intasomen enthält.

Nehmen Sie eine vorgeregelte Säule für die Größenausschlusschromatographie, die mit vernetzten Agarosekügelchen gefüllt ist, und geben Sie das Überstand auf die Säule.

Aufgrund ihrer großen Größe umgehen Proteinaggregate und Intasome die Poren der Kügelchen und eluieren früher.

Kleinere monomere Integrassen und Oligomere dringen in die Poren der Kugeln ein und eluieren später.

Sammeln Sie die früh eluierten Fraktionen, die Intasomen enthalten, für weitere downstream-Analysen.

Bereiten Sie zwei Pipettenspitzen mit großem Durchmesser vor, indem Sie zwei bis vier Millimeter vom Ende einer 200-Mikroliter-Spitze mit einer neuen Rasier- oder Skalpellklinge auf einer sauberen Oberfläche abschneiden. Entfernen Sie die Dialyseschläuche aus dem Dialysepuffer. Um eine Verdünnung der Intasomprobe mit Dialysepuffer zu verhindern, der am Ende der Schläuche nahe der Klammer verbleiben könnte, verwenden Sie eine Mikropipette mit einer kleinen Pipettenspitze, um überschüssigen Dialysepuffer zu entfernen.

Entfernen Sie die Klammer von diesem Ende des Dialysegefäßes. Beim Sammeln des Ansatzes ist es wichtig, so viel wie möglich von der Lösung und dem Niederschlag zu gewinnen. Verwenden Sie die Pipettenspitze mit großem Durchmesser, um die Probe einschließlich des Niederschlags aus dem Dialysegefäß in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis zu überführen.

Notieren Sie das Gesamtvolumen des gewonnenen Materials. Das Gesamtvolumen beträgt typischerweise etwa 140 µL. Die Probe mit Präzipitat liegt bei 200 mM NaCl.

Erhöhen Sie die Salzkonzentration durch Zugabe des entsprechenden Volumens einer 5-molaren Natriumchlorid-Stammlösung auf eine Endkonzentration von 320 Millimolar Natriumchlorid. Überführen Sie den Eiskübel mit der Probe in einen Kaltbereich bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie die Pipettenspitze mit großem Durchmesser, um das Präzipitat durch Pipettieren erneut in Lösung zu suspendieren und aufzulösen.

Wiederholen Sie dies alle 20 Minuten für mindestens eine Stunde. Der größte Teil des Präzipitats sollte in Lösung gehen. Um das Intasom zu reinigen, equilibrieren Sie eine vernetzte Agarose-Größe-Ausschluss-Chromatographie- oder SEC-Säule mit SEC-Laufpuffer bei einer Flussrate von 0,4 Millilitern pro Minute.

Zentrifugieren Sie die Intasom-Probe in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um eventuell verbliebene Präzipitate zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und geben Sie ihn auf eine 200 µL-Injektionsschleife. Applizieren Sie die Probe auf die SEC-Säule.

Eluieren Sie mit 25 Milliliter SEC-Puffer und sammeln Sie 95 Fraktionen zu je 270 Mikroliter. Achten Sie darauf, dass das SEC-Chromatogramm drei A280- und A260-Peaks zeigt.