Gewinnung viraler RNA für die Analyse mittels Real-Time-quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

Beginnen Sie mit einer seriell verdünnten, synthetisierten viralen RNA-Standardlösung im Kulturmedium.

Diese Verdünnungen dienen als Referenzstandards zur Quantifizierung viraler RNA in den Proben.

Entnehmen Sie nun den Überstand, der das Virus aus der virusinfizierten Zellkultur enthält.

Dieses Kulturmedium enthält einen Inhibitor, der an RNA-abbauende Enzyme bindet und den Abbau viraler RNA verhindert.

Fügen Sie den Verarbeitungspuffer, der das Proteinase-K-Enzym enthält, hinzu.

Zentrifugieren Sie die Lösung kurz, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten.

Legen Sie die PCR-Platte mit den Proben in den Thermocycler.

Zunächst bei milder Temperatur inkubieren, um Proteinase K zu aktivieren.

Dieses Enzym verdaut die viralen Proteine, die das Genom umschließen, und setzt virale RNA in die Lösung frei.

Anschließend bei höherer Temperatur inkubieren, um das Enzym zu inaktivieren und die RNA zu denaturieren.

Speichern Sie die aufbereiteten Proben schließlich unter kalten Bedingungen, bis die Analyse mittels Echtzeit-quantitativer PCR durchgeführt wird.

Mischen Sie zunächst 199 Mikroliter Puffer für die Probenvorbereitung mit einem Mikroliter nukleasefreiem Proteinase K. Verdünnen Sie die hergestellte Dengue-Virus-3'-UTR-RNA mittels Zellkulturmedium im Verhältnis 1:10, um RNA-Standards mit Konzentrationen von 5.000.000 bis 5.000 Kopien pro Mikroliter zu erhalten, indem Sie das Pipettieren und Vortexen wiederholen. Überführen Sie 5 Mikroliter des Kulturüberstandes von Dengue-Virus-infizierten Zellen sowie des Dengue-Virus-3'-UTR-RNA-Standards entweder in A2-PCR-Streifen oder in die Vertiefungen einer 96-Loch-PCR-Platte.

Mischen Sie fünf Mikroliter der Lösung enthaltend Verarbeitungspuffer und Proteinase K. Kurz bei 200 ×g für fünf Sekunden zentrifugieren. Die Proben in einem Thermocycler bei 25 Grad Celsius für zehn Minuten und anschließend bei 75 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.