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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:52 Min. • August 31st, 2026
Beginnen Sie mit einer Kultur menschlicher Leberkrebszellen, die mit Hepatitis-E-Virus-(HEV-)RNA transfectiert wurden, um virale Partikel zu erzeugen.
Einige HEV-Viren nehmen eine vom Wirt stammende endosomale Membran auf und verlassen die Zelle, während andere als nicht umhüllte HEV-Viren in der Zelle verbleiben.
Um extrazelluläre HEV-Partikel zu gewinnen, sammeln und filtern Sie das Kulturüberstand, um zelluläres Material zu entfernen.
Aufbewahren bei extrem niedriger Temperatur, um die Infektiosität zu erhalten.
Um intrazelluläre HEV-Partikel zu gewinnen, waschen Sie die Zellen mit einem Puffer.
Fügen Sie Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen zu lösen, und geben Sie anschließend ein Medium zu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.
Übertragen Sie die Suspension in ein Reagenzglas und zentrifugieren Sie sie.
Entfernen Sie den Überstand, der restliches Trypsin enthält. Resuspendieren Sie das Pellet und überführen Sie es in ein Reaktionsgefäß.
Frieren Sie die Zellen in flüssigem Stickstoff ein und tauen Sie sie auf Eis auf.
Wiederholen Sie die Gefrier-Tau-Zyklen, um die Zellen zu lysieren und die Viren freizusetzen.
Zentrifugieren, das Überstand mit den Viren sammeln und bei extrem niedriger Temperatur lagern.
Am sechsten Tag das Überstandmedium durch ein 0,45-Mikrometer-Filter sieben, um zellulären Abfall zu entfernen, und das gewonnene extrazelluläre, kultivierten Hepatitis-E-Virus bei vier Grad Celsius lagern. Zum Ernten intrazellulärer, kultivierter Hepatitis-E-Viruspartikel die Zellen mit PBS waschen und mit 1,5 Millilitern 0,05%igem Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius ablösen. Sobald die Zellen abgelöst sind, die Reaktion mit 8,5 Millilitern DMEM stoppen und die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Gefäß zur Zentrifugation überführen.
Gebe 1,6 Milliliter komplettes DMEM-Medium pro Elektroporation in einzelne 2-Milliliter-Reaktionsröhrchen und verwende 800 Mikroliter des Mediums, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen, wodurch die Zellen in die Röhrchen überführt werden. Gefriere die Zellen dreimal nacheinander in flüssigem Stickstoff ein und taue sie jeweils auf Eis auf, bevor die resultierenden Lysate 10 Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert werden. Danach wird das Überstandsvolumen vorsichtig in neue Röhrchen überführt, ohne die Zelltrümmer-Pellets aufzurühren, und zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt.