Reinigung von Viren aus der Allantoisflüssigkeit von bebrüteten Hühnereiern

Beginnen Sie mit einem Reservoir, das das aus virusinfizierten Hühnereiern gewonnene Allantoisfluid enthält.

Diese Flüssigkeit enthält Viruspartikel zusammen mit vom Wirt stammenden Kontaminanten.

Lassen Sie die Flüssigkeit durch einen Tiefenfilter laufen, um große Verunreinigungen zurückzuhalten, während kleinere Verunreinigungen und Viren passieren können.

Danach wird die gefilterte Flüssigkeit in ein Filtersystem geladen, wo sie tangential über eine Membranoberfläche fließt.

Kleinere Verunreinigungen passieren die Membran, während das Virus zurückgehalten und angereichert wird.

Den konzentrierten Virus auf ein Dichtegradienten auftragen und zentrifugieren. Der Virus bildet eine deutliche Bande, wo seine Dichte der des Gradienten entspricht.

Sammeln Sie die virusreiche Bande in einer Dialyseskassette und geben Sie sie in ein Pufferlösung. Die Gradientenkomponenten diffundieren nach außen, während Wasser aus dem Puffer durch die semipermeable Membran in die Kassette diffundiert.

Als Nächstes wird die Kartusche in eine hypertonische Lösung gegeben, um Wasser zu entziehen und das gereinigte Virus zu konzentrieren.

Zur Reinigung des Newcastle Disease Virus oder NDV prime zunächst das zuvor eingerichtete experimentelle System, indem 50 Milliliter PBS hindurchgeleitet werden.

Stoppen Sie die Pumpe, wenn etwa fünf Milliliter PBS im Rohr verbleiben. Befestigen Sie anschließend einen Tiefenfilter mit einer Rückhaltegröße von einem bis drei Mikrometern an der Schlauchleitung. Um den Filter zu entlüften, entfernen Sie die zweite Kappe auf der apikalen Seite des Tiefenfilters und leiten dann weitere 50 Milliliter PBS durch das System.

Sobald das PBS durch die Entlüftung an der Oberseite des Filters fließt, schließen Sie den Anschluss und lassen das PBS weiter durch die Leitungen fließen. Danach ersetzen Sie das Abfallgefäß durch ein neues steriles Sammelgefäß und leiten das Allantoisfluid durch den Tiefenfilter. Richten Sie anschließend das Tangentialfluss-Filtrationssystem (TFF) in offener Konfiguration ein und betreiben Sie es, wie in der Publikation beschrieben.

Wenn etwa fünf Milliliter Flüssigkeit im Reservoir verbleiben, pumpen Sie die Pumpe an und fügen Sie dem Reservoir tiefenfiltriertes Allantoisfluid hinzu. Setzen Sie dann den Pumpenfluss fort. Um eine Schädigung des Virus durch Scherkräfte zu vermeiden, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Systemdruck 10 Pfund pro Quadratzoll nicht überschreitet.

Um die Elution zu erhöhen, sollte eine Kombination aus der Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe und der C-Klemme verwendet werden. 150 bis 100 Milliliter Allantoisflüssigkeit im Reservoir belassen, die Pumpe anhalten und den Puffer durch Zugabe von 150 bis 200 Milliliter ML-Puffer wechseln. Die Pumpe erneut anhalten, wenn noch fünf bis zehn Milliliter Flüssigkeit im Reservoir verbleiben, dann mit zwei C-Klammern die Abfallleitungen schließen.

Trennen Sie die Retentatleitung, die den Vorratstank speist, und führen Sie sie in ein 50-Milliliter-Konischke-Gefäß ein. Setzen Sie dann den Durchfluss fort und unterbrechen Sie ihn, wenn nur noch wenige Tropfen Flüssigkeit im Vorratstank verbleiben. Entfernen Sie anschließend die C-Klemmen von den Abfallleitungen und verbinden Sie die Retentatzufuhrleitung wieder mit dem Vorratstank.

Unterdessen, um die Iodixanol-Dichtegradient-Ultrazentrifugation vorzubereiten, zunächst 0,5 Milliliter 40 %iges Iodixanol in eine 13,2-Milliliter-Open-Top-Dünnewand-Ultrazentrifugenröhre geben. Anschließend die Säule durch sukzessive Zugabe von 2,5 Milliliter 20 %igem Iodixanol und 2,5 Milliliter 10 %igem Iodixanol bereitstellen. Vor der Ultrazentrifugation vorsichtig sechs bis 6,5 Milliliter der aus dem TFF-System eluierten Viruslösung auf die Iodixanolsäule geben, ohne den Gradienten zu stören.

Nach der Ultrazentrifugation die Röhrchen mit einer sterilen Pinzette entfernen. Das Zielband sollte ein breites Band zwischen den 10- und 20-%-Gradienten sein. Danach das Röhrchen mithilfe eines Reagenzglashalters über dem Rand eines Bechers aufhängen.

Danach eine 1,5 Zoll lange Nadel mit 18 Gauge an eine fünf Milliliter große Spritze anbringen, die Seite des Ultrazentrifugenröhrchens mit der Nadel durchstechen und das Zielband vorsichtig durch langsames Herausschieben des Kolbens abzusaugen. Nachdem das Iodixanol gemäß der Beschreibung im Manuskript aus der Viruslösung entfernt wurde, die Viruslösung vorsichtig mittels einer Spritze in eine Dialysiskassette einführen. Um die Viruslösung zu konzentrieren, die Dialysiskassette aus dem Dialysepuffer nehmen und in eine kleine verschließbare Plastiktüte legen.

Danach 15 bis 25 Milliliter einer 40 %igen Polyethylenglykollösung in den Beutel geben, sodass die Dialysiskassette vollständig bedeckt ist.