Sendai-Virus-vermittelte Reprogrammierung menschlicher Blutzellen in induzierte pluripotente Stammzellen

Entnehmen Sie eine Kultur menschlicher peripherer mononuklearer Blutzellen (PBMCs).

Fügen Sie das Sendai-Virus hinzu, das Reprogrammierungstranskriptionsfaktoren kodiert. Decken Sie die Platte ab und versiegeln Sie sie.

Zentrifugieren, um den Virus-Zell-Kontakt zu verbessern, und anschließend inkubieren.

Nach der Virusfusion exprimiert die virale RNA Transkriptionsfaktoren, die zelluläre Pluripotenzgene aktivieren und linien-spezifische Gene unterdrücken, um die Reprogrammierung einzuleiten.

Dabei wandelt sich eine Teilmenge der transduzierten PBMCs in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) um und exprimiert Adhäsionsproteine.

Überführen Sie sie in eine matrixbeschichtete Vertiefung und zentrifugieren Sie die Zellen. Ersetzen Sie den Überstand durch ein Wachstumsmedium.

Nach der Inkubation heften sich die iPSCs an die Matrix an, während transduzierte nicht-anklebende PBMCs in Suspension verbleiben.

Übertragen Sie die Suspension in einen beschichteten Well und zentrifugieren Sie sie. Geben Sie das Medium in den ursprünglichen Well und inkubieren Sie beide.

Die verbleibenden transduzierten PBMCs beginnen die Umprogrammierung, wandeln sich in iPSCs um und heften sich an. Dieser Schritt maximiert die Retention der umprogrammierten Zellen.

Ersetzen Sie das Medium täglich, um das Wachstum der iPSCs aufrechtzuerhalten.

Bei diesem Verfahren überführen Sie die Blutzellen in eine 15-Milliliter-Konischflasche und zählen Sie mithilfe eines Hämozytometers. Bereiten Sie anschließend 3 × 10⁵ Zellen für die Transduktion vor und zentrifugieren Sie die Zellen bei 515 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Anschließend den Überstand durch Absaugen entfernen und die Zellen in 0,5 Milliliter Blutzellmedium resuspendieren. Danach die Zellen in eine Vertiefung einer nicht beschichteten 24-Loch-Platte überführen. Die Sendai-Virus-Mischung auf Eis auftauen und zu den suspendierten Zellen hinzufügen.

Versiegeln Sie die Platte mit einer Versiegelungsfolie und zentrifugieren Sie sie bei 1.150 × g für 30 Minuten bei 30 °C. Nach der Zentrifugation inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in 5 % CO2. Um eine 24-Lochplatte mit Vitronectin zu beschichten, verdünnen Sie am nächsten Tag die Vitronectin-Lösung in PBS, um eine Endkonzentration von 5 µg/ml zu erhalten.

Fügen Sie anschließend ein Milliliter Vitronectin in eine Vertiefung hinzu und inkubieren Sie es mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach entfernen Sie die Beschichtungslösung und überführen das gesamte Medium mit den Zellen und dem Virus in die beschichtete Vertiefung. Sammeln Sie dann die verbleibenden Zellen mit einem zusätzlichen 0,5 Milliliter frischem Blutzellmedium und geben Sie es der zellhaltigen Vertiefung hinzu.

Anschließend die Platte bei 1.150 × g für zehn Minuten bei 35 °C zentrifugieren und die Zellen anschließend über Nacht bei 37 °C in 5 % CO₂ kultivieren. Für die zweite Zellübertragung die Vertiefung mit 5 µg/ml Vitronectin wie zuvor beschrieben beschichten. Für jede Transduktion eine Vertiefung der Platte verwenden und die Zellsuspension von der ersten Platte auf die neu beschichtete Vitronectin-Platte übertragen.

Unterdessen ein Milliliter iPSC-Medium in eine Vertiefung der ersten Platte zur Erhaltung geben und bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren, wobei täglich ein Mediumwechsel mit frischem iPSC-Medium erfolgt. Kolonien erscheinen am 14. bis 21. Tag nach der Transduktion. Die neu beschichtete Platte mit den suspendierten Zellen bei 1.150 × g und 35 Grad Celsius zehn Minuten lang zentrifugieren.

Nach der Zentrifugation die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag das Überstand entfernen und durch frisches Kulturmedium für induzierte pluripotente Stammzellen ersetzen. Die angehefteten Zellen mit täglichem Mediumwechsel pflegen, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.