Analyse der Internalisierung des Influenza-Virus mittels eines Streptavidin-Blocking-Assays

Beginnen Sie mit Röhrchen, die humane Lungepithelzellen enthalten.

Fügen Sie biotinylierte Influenzaviren hinzu und inkubieren Sie auf Eis. Die Viren binden an die Zelloberfläche, werden dabei aber nicht internalisiert.

Zentrifugieren Sie, um die virusgebundenen Zellen zu trennen, entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen.

Fügen Sie in die Probe des Anfangszeitpunkts unbezeichnetes Streptavidin hinzu, das an die biotinylierten Viren bindet und Komplexe bildet.

Geben Sie fluorophor-markiertes Streptavidin hinzu, das nicht an den Streptavidin-Biotin-Virus-Komplex bindet. Waschen und fixieren Sie die Zellen.

Die Probe des späteren Zeitpunkts bei einer höheren Temperatur inkubieren, um die Virus-Internalisierung zu ermöglichen, dann wieder auf Eis stellen.

Unmarkierten Streptavidin und ein Internalisierungs-blockierendes Agens, das eine weitere virale Aufnahme verhindert, hinzufügen und inkubieren. Streptavidin bindet biotinylierte, an der Oberfläche gebundene Viren, anschließend waschen.

Fixieren Sie die Zellen und geben Sie einen Puffer mit Tensid hinzu, um sie zu permeabilisieren.

Waschen und fluorophor-markiertes Streptavidin hinzufügen, das in die Zellen eindringt und an Biotin bindet.

Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie.

Eine höhere Fluoreszenz zum späteren Zeitpunkt bestätigt eine erfolgreiche virale Internalisierung.

Nachdem der Waschschritt erneut durchgeführt wurde, kühlen Sie die Röhrchen 10 Minuten auf Eis ab. Sobald die Röhrchen abgekühlt sind, zentrifugieren Sie erneut und verwenden Sie 100 Mikroliter biotinyliertes Virus, das in Infektions-PBS verdünnt wurde, um die Pellets nach einer einstündigen Inkubation auf Eis aufzusuchen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und waschen Sie zweimal mit PBS, wobei die folgenden Proben parallel zueinander so weit wie möglich für die Null-Minuten-Proben verarbeitet werden.

Um die Null-Minuten-Plus-STV-Proben zu behandeln, zentrifugieren Sie die Röhrchen, entfernen Sie das Überstand und verwenden Sie 15 Mikroliter STV mit 2 % BSA und 0,1 % Natriumazid in PBS, um das Zellpellet erneut aufzuschwemmen. Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Anschließend zentrifugieren und die Zellen zweimal mit PBS waschen, nachdem sie wie gerade gezeigt mit PFA fixiert wurden, und lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius.

Für die Proben mit 30 Minuten plus STV. Nach dem Pellettieren die Proben in 200 µL PBS mit 2% BSA resuspendieren, nach einer Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten.

Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 50 µL STV mit 2 % BSA und 0,1 % Natriumazid in PBS. Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis, bevor Sie waschen und fixieren. Danach, nach Permeabilisierung und Färbung aller Proben mit STV-Cy3 gemäß den Angaben im textbasierten Protokoll, lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius. Analysieren Sie die Proben abschließend per Durchflusszytometrie.