Beurteilung der phagenvermittelten Hemmung des Bakterienwachstums mittels Messung der optischen Dichte

Beginnen Sie mit einer Mehrfachbrüheplatte, die eine seriell verdünnte Phagensuspension in nährstoffreichem Brühe als Behandlung und phagenfreie Brühe als Kontrolle enthält.

Fügen Sie E. coli in jede Vertiefung hinzu. Messen Sie mithilfe eines Spektrophotometers die Ausgangs-Optische Dichte (OD), um die anfängliche Bakterienkonzentration zu erfassen.

Als Nächstes inkubieren Sie die Platte, um das bakterielle Wachstum und die Phageninfektion zu ermöglichen.

In der Kontrolle nutzen die Bakterien Nährstoffe und vermehren sich, wodurch der optische Dichtewert (OD) ansteigt.

Bei der Behandlung binden Phagen an bakterielle Oberflächenrezeptoren und injizieren ihr Genom in das Zytoplasma.

Unter Verwendung der Wirtszellmaschinerie repliziert das virale Genom und produziert virale Proteine, die sich zu neuen Viruspartikeln zusammenlagern. Diese Partikel lysieren die Zelle und setzen Nachkommen frei.

Messen Sie den OD in Intervallen, um das bakterielle Wachstum zu vergleichen.

Die Kontrollbohrungen zeigen einen progressiven Anstieg der Extinktion, während die mit Phagen behandelten Bohrungen niedrigere Extinktionswerte aufweisen, wobei stärkere Abnahmen bei höheren Phagenkonzentrationen beobachtet werden.

Dies hilft dabei, die Phagenkonzentration zu bestimmen, die für eine maximale Hemmung des bakteriellen Wachstums erforderlich ist.

Beginnen Sie mit dem Einrichten des Mikroplattenassays unter Verwendung von Filtertips, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Fügen Sie zunächst 180 Mikroliter mTSB in die Vertiefungen der Spalten eins bis 12 der 96-Well-Mikroplatte hinzu. Bereiten Sie anschließend serielle zehnfache Verdünnungen jedes Phagen in den Spalten eins bis acht der sterilen 96-Well-Mikroplatten vor, um den Assay einzurichten. Geben Sie 20 Mikroliter einzelner Phagen oder Phagen-Cocktails in die Vertiefungen eins bis acht der obersten Reihe A der Mikroplatte.

Fügen Sie für die phagenfreie und leere Kontrolle 20 Mikroliter mTSB in das oberste Well der Spalten neun bis 12 hinzu. Während des Pipettierens mischen Sie den Inhalt der Wells durch wiederholtes, sanftes Auf- und Abpipettieren mindestens fünfmal und wechseln die Spitzen zwischen den Verdünnungen. Entfernen Sie 20 Mikroliter aus der letzten Reihe H und bereiten Sie anschließend ein Reservoir für den getesteten Bakterienstamm vor, indem Sie zwei bis drei Milliliter der verdünnten Kultur mit einer Ein-Milliliter-Pipette in das Reservoir überführen.

Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur in jede Vertiefung der Spalten eins bis 10 geben, wobei zwischen jeder Zugabe die Pipettenspitzen gewechselt werden. Die Mikrotiterplatte abdecken und bei 37 Grad Celsius inkubieren. In Zwei-Stunden-Abständen die Mikrotiterplatte aus dem Inkubator entnehmen und mit einem Mikrotiterplatten-Reader auswerten.

Alternativ die Platte in einem Mikroplatten-Reader inkubieren und über einen bestimmten Zeitraum messen.