JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:48 Min. • August 31st, 2026
Entnehmen Sie eine Zellkultur aus sich in der stationären Phase befindlichen Säugetierzellen mit minimaler DNA-Replikation und sammeln Sie das konditionierte Medium.
Fügen Sie Herpes-simplex-Virus (HSV) hinzu und inkubieren Sie unter gelegentlichem Schütteln, um die virale Anheftung zu ermöglichen. Waschen Sie, um nicht gebundenes Virus zu entfernen, und geben Sie das konditionierte Medium wieder dazu.
Nach der Inkubation fusioniert das Virus mit der Wirtsmembran und setzt das Nukleokapsid in das Zytoplasma frei.
Die virale dsDNA gelangt in den Zellkern, zirkularisiert und exprimiert virale Proteine für die virale DNA-Replikation.
Die viralen und Wirtseigenen Proteine entwinden die virale DNA und synthetisieren einen RNA-Primer. Anschließend bindet der virale DNA-Polymerase-Komplex und verlängert den Primer zur DNA-Synthese.
Während der Fortschritt der Replikation fügen Sie ein Nukleosidanalogon zum Kulturmedium hinzu. Es gelangt in die Zellen und wird in die Triphosphatform umgewandelt.
Da die Replikation der Wirt-DNA minimal ist, wird das Analogon vorzugsweise in die replizierende virale DNA eingebaut und markiert so die viralen Genome.
Die markierten viralen Genome stehen bereit für die nachgeschaltete proteomische Analyse der assoziierten Proteine.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Kultivieren von MRC-5-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie anschließend HSV-1 in kalter Tris-gepufferter Salzlösung oder TBS. Für die folgenden Schritte ist es wichtig, den Gebläseventilator und die Gewebekulturhaube auszuschalten, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen.
Überführen Sie mit einer Pipette das Wachstumsmedium der MRC-5-Zellen in eine sterile Flasche, um es nach der Infektion wieder den Zellen zuzufügen. Infizieren Sie die Zellen, indem Sie sieben Milliliter verdünntes Virus zu den Zellen geben. Schwenken Sie die Zellen jede 10 Minuten über eine Stunde bei Raumtemperatur.
Nach der Adsorption das Inokulum abpipettieren, die Zellen mit 50 Milliliter TBS bei Raumtemperatur spülen und das ursprüngliche Wachstumsmedium ersetzen. Anschließend die Zellen bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach Beginn der viralen DNA-Replikation, etwa vier Stunden nach der Infektion, die replizierende virale DNA markieren.
Verdünnen Sie hierzu EdC in einem Milliliter Wachstumsmedium und geben Sie es zwei bis vier Stunden lang zum Kulturmedium infizierter Zellen hinzu.