Isolierung von Proteinen aus viralen DNA-Protein-Komplexen

Entnehmen Sie die Zellkerne, die virale Genome enthalten, die mit alkinmodifizierten Nukleotiden markiert sind.

Suspendieren Sie die Kerne in einer Mischung aus Biotin-Azid und Kupferionen, und inkubieren Sie.

Das Kupferion unterstützt die kovalente Bindung der Azid- und der Alkin-Gruppe.

Zentrifugieren und das Überstand entfernen.

In Puffer resuspendieren, übertragen und zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden.

Blitzgefrieren und anschließendes Auftauen des Pellets zur Unterstützung der Lyse.

Suspendieren und beschallen, um die Kerne zu lysieren.

Zentrifugieren und das Überstand, der Protein-virale DNA-Komplexe enthält, sammeln.

Filtern Sie das Überstand, um Kontaminationen zu entfernen.

Verdünnen Sie das Filtrat.

Geben Sie magnetische Biotin-Bindungsperlen mit Streptavidin-Beschichtung hinzu und inkubieren Sie, um die Bindung an biotinylierte Protein-DNA-Komplexe zu ermöglichen.

Ein Magnetfeld anlegen, um die Kügelchen zu sammeln, und waschen, um Verunreinigungen zu entfernen.

Wiederholen Sie den Waschschritt.

Fügen Sie einen Elutionspuffer hinzu und erhitzen Sie, um die Proteine zu trennen und zu denaturieren.

Trennen Sie die Kügelchen und sammeln Sie das Eluat.

Tiefgefrieren Sie die isolierten Proteine. Lagern Sie sie bei extrem niedrigen Temperaturen für weitere Analysen.

Nachdem das PBS vollständig entfernt wurde, resuspendieren Sie das nukleäre Pellet in 10 Milliliter Click-Reaktionsgemisch, indem Sie fünfmal vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Pipette auf- und abpipettieren. Inkubieren Sie die Probe unter Rühren eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Kerne wie zuvor pelletieren.

Entfernen Sie die Click-Reaktionsmischung vollständig, waschen Sie dann das Pellet, indem Sie es vorsichtig in 10 Milliliter PBS resuspendieren und erneut zentrifugieren. Resuspendieren Sie das nukleäre Pellet anschließend vorsichtig in einem Milliliter PBS und überführen Sie die Lösung in eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrobe. Nach der Zentrifugation entfernen Sie das PBS vollständig und schockgefrieren das Pellet in flüssigem Stickstoff.

An diesem Punkt kann das Pellet bei -80 °C aufbewahrt werden, oder das Verfahren kann fortgesetzt werden. Um die Kerne zu lysieren und die DNA zu fragmentieren, resuspendieren Sie die aufgetauten Kerne durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in 500 µL Puffer B1. Inkubieren Sie die Suspension 45 Minuten lang auf Eis.

Anschießend die Proben sechsmal für jeweils 30 Sekunden bei 40 % Amplitude sonifizieren, wobei eine 3-mm-Mikrotipprobe verwendet wird. Die Proben zwischen den Impulsen mindestens 30 Sekunden lang auf Eis abkühlen. Nach der Sonifizierung sollten die Proben klar, nicht trüb erscheinen.

Zentrifugieren Sie die Zelltrümmer bei 14.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um den Zelltrümmerpellet zu pelletieren. Die Pelletgröße sollte deutlich abnehmen. Filtrieren Sie das Überstand durch einen Zellfilter mit 100 Mikrometer Porengröße und sammeln Sie den Durchlauf. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Puffer B2 zum filtrierten Überstand hinzu.

Um die biotinylierte DNA an Streptavidin-beschichtete Kugeln zu binden, bereiten Sie die Streptavidin-Magnetkugeln vor, indem Sie 300 Mikroliter Kugelsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bereiten Sie pro Probe ein Röhrchen mit Kugeln vor. Waschen Sie die Kugeln dreimal mit je einem Milliliter Puffer B2, indem Sie kurz aufwirbeln, um die Kugeln erneut in Suspension zu bringen, dann ans Magnetfeld bringen, um die Kugeln abzutrennen, und anschließend den Waschpuffer abzusaugen.

Dann 900 Mikroliter der Probe zu den gewaschenen Kügelchen hinzufügen. Der verbleibende Teil der Probe wird für die Isolierung von Input-DNA und -Protein verwendet. Die Suspension über Nacht bei vier Grad Celsius rotieren lassen.

Am nächsten Tag die Proben in einen magnetischen Mikrozentrifugenröhrchenständer stellen und den Überstand entfernen. Die Kügelchen vorsichtig in einem Milliliter Puffer B2 resuspendieren, anschließend fünf Minuten bei vier Grad Celsius rotieren lassen. Den Überstand erneut mithilfe des magnetischen Mikrozentrifugenröhrchenständers entfernen.

Dieses Mal die Perlen vorsichtig in einem Milliliter Puffer B3 resuspendieren und bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang rotieren lassen. Nach dem Entfernen des Überstandes der Perlenmischung mithilfe des Magneten die Perlen in 50 Mikroliter 2x Laemmli-Probe-Puffer resuspendieren, um DNA-Protein-Komplexe zu eluieren. Anschließend die Proben 15 Minuten bei 95 Grad Celsius kochen.

Vortexen Sie eine Mischung, bevor Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge spinnen. Tragen Sie die Proben auf das Magnetfeld auf und überführen Sie das Eluat in ein neues Gefäß. Schlussendlich gefriert man die Proben rasch ein und lagert sie bei 80 Grad Celsius.

Führen Sie die Proteinanalyse wie im Textprotokoll beschrieben durch.