Ein 3D-gedrucktes, silikonbeschichtetes Gerät zur Modellierung von katheterassoziierten Harnwegsinfektionen

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit sterilem menschlichen Urin.

Beimpfen Sie die Testvertiefungen mit Bakterien. Die Kontrollvertiefungen enthalten nur Urin.

Nehmen Sie ein 3D-gedrucktes, silikonbeschichtetes Gerät, das die Innenfläche eines Katheters nachahmt, auf der sich bei katheterassoziierten Harnwegsinfektionen Biofilme bilden.

Legen Sie es in die Vertiefungen, verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie es.

Bakterien heften sich an die Geräteoberfläche, verwerten Nährstoffe aus dem Urin und bilden Biofilme.

Spülen Sie das Gerät mit einem Puffer ab, um lose gebundene Bakterien zu entfernen.

Legen Sie das Gerät in eine Multiwell-Platte, die Kristallviolett enthält, das mit dem Biofilm interagiert, um ihn zu färben.

Mit Wasser abspülen und trocknen.

Tauchen Sie das Gerät in eine Multi-Well-Platte, die eine saure Lösung enthält, um die Wechselwirkungen zwischen Farbstoff und Biofilm zu unterbrechen und den Farbstoff in die Lösung freizusetzen.

Messen Sie die Absorption der Lösungen in jeder Vertiefung mit einem Spektralphotometer.

Eine höhere Extinktion in den Testvertiefungen im Vergleich zu den Kontrollvertiefungen bestätigt die Biofilmbildung auf dem Gerät und deutet auf seine Eignung zur Modellierung katheterassoziierter Harnwegsinfektionen hin.

Entnehmen Sie zunächst eine gepoolte menschliche Urinprobe. Aliquotieren Sie 135 Mikroliter gepoolten menschlichen Urins in jede Testvertiefung einer 96-Well-Platte nach dem angegebenen Layout.

Beimpfen Sie jede Testvertiefung mit 15 Mikrolitern normalisierter Bakterienkultur über Nacht, um ein Endvolumen von 150 Mikrolitern pro Vertiefung zu erreichen. Reservieren Sie mindestens 100 Mikroliter dieser Kultur für nachfolgende Validierungsschritte der seriellen Verdünnung.

Bereiten Sie Negativkontrollvertiefungen vor, indem Sie 150 Mikroliter steril gepoolten menschlichen Urin in dafür vorgesehene Vertiefungen geben.

Setzen Sie nun die Stifte in die entsprechenden Vertiefungen ein. Drücken Sie den Stiftdeckel nach unten, bis er bündig auf der Platte sitzt, und sichern Sie ihn mit dem Mikroplattendeckel und kleben Sie ihn bei Bedarf fest.

Legen Sie dann die Hering-Modelle in eine versiegelte Plastikwanne oder einen Beutel mit einer feuchten blauen Rolle, um eine Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie 24 Stunden lang statisch bei 37 Grad Celsius.

Für die Inokulumvalidierung aliquotieren Sie 180 Mikroliter PBS in den Zeilen 2 bis 6 der ersten Spalte einer 96-Well-Platte, bevor Sie die reservierte Kultur hinzufügen.

Übertragen Sie nun 20 Mikroliter aus der ersten Vertiefung in die zweite Vertiefung und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren. Die serielle Verdünnung wird fortgesetzt, bis das ursprüngliche Inokulum zur endgültigen Vertiefung verdünnt wurde.

Anschließend werden 10 Mikroliter Spots aus jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung auf geeignete feste Medien aufgebracht. Nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius zählen Sie die Bienenvölker von jedem Fleck.

Für die Quantifizierung von Biofilmen nehmen Sie das Peg-Modell von der Mikroplatte und drehen Sie es unter einer Flamme oder in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank um, wobei die Stifte nach oben zeigen. Entsorgen Sie die gebrauchten Mikroplatten.

Übertragen Sie den Peg-Deckel auf eine frische Mikroplatte mit 180 Mikrolitern Aliquots sterilem PBS, um nicht anhaftende Zellen abzuspülen.

Platzieren Sie anschließend aseptisch ein Reagenzglasgestell aus sterilem Glas auf dem Tisch und befestigen Sie die passende Rack-Oberseite, die den Stiftdeckel hält.

Aliquotieren Sie mit einer Mikropipette 600 Mikroliter steriles PBS in jedes Reagenzglas. Setzen Sie nun den Stiftdeckel in das Gestell ein und stellen Sie sicher, dass die Stifte mit den Reagenzgläsern ausgerichtet sind. Entfernen Sie das Autoklavenband vom Deckel.

Schiebe jeden Stift mit einer sterilen Pinzette durch den Deckel in die Reagenzgläser direkt darunter. Setzen Sie dann die Reagenzglaskappen wieder auf und wirbeln Sie jedes Röhrchen 60 Sekunden lang durch, um Biofilm-assoziierte Zellen zu entfernen.

Entfernen Sie 100 Mikroliter aus jedem Wirbelröhrchen und führen Sie wie zuvor serielle Verdünnungen in sterilem PBS durch.

Um die Zellen mit Kristallviolett zu färben, pipettieren Sie 180 Mikroliter mit 0,1 Gewichtsprozent pro Volumen Kristallviolett in sterilem destilliertem Wasser in die 24 Testvertiefungen einer 96-Well-Platte. Setzen Sie das gespülte Stiftmodell in die entsprechenden Vertiefungen ein und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach dem Färben das Stiftmodell von der Platte und entsorgen Sie die gebrauchte Platte. Spülen Sie das gesamte Hering-Modell in einer sauberen Wanne unter fließendem Leitungswasser unter leichtem Rühren ab.

Nach 2 weiteren Wäschen drehen Sie das Hering-Modell um und lassen Sie es vollständig bei Raumtemperatur trocknen. Geben Sie dann 180 Mikroliter 30%ige Essigsäure in eine neue 96-Well-Platte. Setzen Sie das getrocknete Stiftmodell in die entsprechenden Vertiefungen ein.

Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Peg-Modell von der Mikrotiterplatte. Messen Sie die optische Dichte der gefärbten Wells bei 540 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader oder Spektralphotometer.