Cäsiumchlorid-basierte Reinigung von genomhaltigen adenoviralen Vektoren

Beginnen Sie mit infizierten Säugetierzellen, die mit einem Adenovirus infiziert wurden.

Führen Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen durch, um die Zellen zu lysieren und die Virionen freizusetzen.

Zentrifugieren Sie das Lysat, um den Zelltrümmern zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand, der die viralen Partikel enthält.

Schichten Sie das virale Überstand auf einen gestuften Cäsiumchlorid-Gradienten zur dichteabhängigen Trennung auf.

Ultrazentrifugieren Sie, um die Virenpartikel entsprechend ihren Auftriebsdichten wandern zu lassen.

Intakte Virionen, die das vollständige Adenovirusgenom enthalten, sind aufgrund der verpackten DNA dichter und sammeln sich in einer unteren Bande, während leichtere, leere Kapside und Zelltrümmer in den oberen Schichten verbleiben.

Entfernen Sie die oberen Schichten. Sammeln Sie das untere Band der genomhaltigen Virionen.

Suspendieren Sie die Virionen in Cäsiumchlorid mit einheitlicher Dichte und führen Sie eine erneute Ultrazentrifugation durch, um die Trennung zu verfeinern und die vollständigen Partikel anzureichern.

Entfernen Sie die oberen Schichten und gewinnen Sie das untere Band.

Dialysieren Sie die Probe, um das Cäsiumchlorid zu entfernen.

Die hochreinen, genomhaltigen adenoviralen Vektoren sind nun bereit für nachgeschaltete Anwendungen.

Um das virale Lysat für die Cäsiumchlorid-Gradientenreinigung vorzubereiten, frieren Sie die Zellvirus-Suspension viermal ein und tauen Sie sie wieder auf. Zentrifugieren Sie anschließend das virale Lysat bei 500 × g für acht Minuten bei Raumtemperatur.

Danach sammeln Sie den Überstand, der das hochkapazitive Adenovirus enthält. Pipettieren Sie vorsichtig und langsam Cäsiumchloridlösungen in die Röhrchen in der folgenden Reihenfolge: 0,5 Milliliter einer Lösung mit 1,5 Gramm pro Kubikzentimeter, drei Milliliter einer Lösung mit 1,35 Gramm pro Kubikzentimeter und 3,5 Milliliter einer Lösung mit 1,25 Gramm pro Kubikzentimeter. Überlagern Sie etwa 4,5 Milliliter des geklärten Vektor-Überstands auf der Schicht mit 1,25 Gramm pro Kubikzentimeter.

Zentrifugieren Sie die Gradienten in einem Ultrazentrifugengerät mit einem Schwingrotor bei 12 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden bei 226.000 × g, um die viralen Partikel, die das Genom des hochkapazitiven Adenovirus enthalten, von leeren Partikeln und Zelltrümmern zu trennen. Nach der Zentrifugation bildet sich ein diffuses Band aus Zelltrümmern an der Oberseite der Röhrchen. Darunter sind zwei weiße Bänder sichtbar.

Das obere Band enthält leere Partikel, während das untere Band das hochkapazitive Adenovirus darstellt. Entfernen Sie vorsichtig die Schichten aus Zelltrümmern und leeren Partikeln. Sammeln Sie anschließend ein Milliliter des unteren Bands aus jedem Röhrchen ein.

Überführen Sie das Virus in ein steriles 50-Milliliter-Gefäß. Geben Sie bis zu 24 Milliliter einer 1,35 Gramm pro Kubikzentimeter schweren Cäsiumchloridlösung zu den gesammelten Viruspartikeln hinzu und mischen Sie vorsichtig. Füllen Sie die Zentrifugenröhrchen bis zum Rand mit der 1,35 Gramm pro Kubikzentimeter schweren Cäsiumchlorid-Viruslösung auf.

Anschließend über Nacht bei 226.000 × g bei 12 °C in einem Ultrazentrifugiergerät mit Schwingrotor und langsamer Beschleunigung sowie Verzögerung zentrifugieren. Die oberen Schichten von oben mit einer Pipette entfernen. Danach das im ausgeprägten unteren Band vorhandene High-Capacity-Adenovirus mit einer frischen Pipettenspitze sammeln.

Schließlich dialysieren Sie die gesammelten Viruspartikel zur Pufferaustauschung und bestimmen anschließend die Titer der endgültigen Präparation gemäß den ausführlichen Anweisungen im schriftlichen Protokoll.